Diferencijalna dijagnoza plućnih čvorova identifikovanih kompjuterizovanom tomografijom (CT) ostaje izazov u kliničkoj praksi.Ovdje karakteriziramo globalni metabolom od 480 uzoraka seruma, uključujući zdrave kontrole, benigne čvorove pluća i adenokarcinom pluća I stadija.Adenokarcinomi pokazuju jedinstvene metabolomske profile, dok benigni noduli i zdravi pojedinci imaju veliku sličnost u metabolomskim profilima.U grupi otkrića (n = 306), identificiran je skup od 27 metabolita kako bi se razlikovali između benignih i malignih čvorova.AUC diskriminantnog modela u grupama za internu validaciju (n = 104) i eksternu validaciju (n = 111) bio je 0,915 i 0,945, respektivno.Analiza puta je otkrila povećane glikolitičke metabolite povezane sa smanjenjem triptofana u serumu adenokarcinoma pluća u usporedbi s benignim čvorovima i zdravim kontrolama, te sugerira da unos triptofana potiče glikolizu u stanicama raka pluća.Naša studija naglašava vrijednost biomarkera metabolita u serumu u procjeni rizika od plućnih nodula otkrivenih CT-om.
Rana dijagnoza je ključna za poboljšanje stope preživljavanja pacijenata sa rakom.Rezultati američkog Nacionalnog ispitivanja karcinoma pluća (NLST) i evropske NELSON studije pokazali su da skrining sa niskom dozom kompjuterizovane tomografije (LDCT) može značajno smanjiti smrtnost od raka pluća u grupama visokog rizika1,2,3.Od raširene upotrebe LDCT-a za skrining karcinoma pluća, incidencija slučajnih radiografskih nalaza asimptomatskih plućnih čvorova nastavila je rasti 4 .Plućni čvorovi se definišu kao fokalne opacitete do 3 cm u prečniku 5 .Suočavamo se s poteškoćama u procjeni vjerovatnoće maligniteta i rješavanju velikog broja plućnih čvorova slučajno otkrivenih na LDCT-u.Ograničenja CT-a mogu dovesti do čestih kontrolnih pregleda i lažno pozitivnih rezultata, što dovodi do nepotrebne intervencije i pretjeranog liječenja6.Stoga postoji potreba da se razviju pouzdani i korisni biomarkeri za ispravnu identifikaciju karcinoma pluća u ranim fazama i diferenciranje većine benignih čvorova pri početnom otkrivanju 7 .
Sveobuhvatna molekularna analiza krvi (serum, plazma, mononuklearne ćelije periferne krvi), uključujući genomiku, proteomiku ili DNK metilaciju8,9,10, dovela je do sve većeg interesa za otkrivanje dijagnostičkih biomarkera za rak pluća.U međuvremenu, metabolomički pristupi mjere ćelijske krajnje proizvode na koje utječu endogena i egzogena djelovanja i stoga se primjenjuju za predviđanje početka i ishoda bolesti.Tekuća hromatografija-tandem masena spektrometrija (LC-MS) je široko korištena metoda za metabolomičke studije zbog svoje visoke osjetljivosti i velikog dinamičkog raspona, koji može pokriti metabolite različitih fizičko-hemijskih svojstava11,12,13.Iako je globalna metabolomska analiza plazme/seruma korištena za identifikaciju biomarkera povezanih s dijagnozom karcinoma pluća14,15,16,17 i djelotvornošću liječenja18, klasifikatori serumskih metabolita za razlikovanje benignih i malignih plućnih nodula ostaju da se dosta proučavaju.-masivno istraživanje.
Adenokarcinom i karcinom skvamoznih ćelija su dva glavna podtipa karcinoma ne-malih ćelija pluća (NSCLC).Različiti CT skrining testovi pokazuju da je adenokarcinom najčešći histološki tip raka pluća1,19,20,21.U ovoj studiji smo koristili ultra-performansnu tečnu hromatografiju-masenu spektrometriju visoke rezolucije (UPLC-HRMS) da izvršimo metabolomičku analizu na ukupno 695 uzoraka seruma, uključujući zdrave kontrole, benigne plućne čvorove i CT-otkrivene ≤3 cm.Skrining za stadijum I plućnog adenokarcinoma.Identifikovali smo panel serumskih metabolita koji razlikuju adenokarcinom pluća od benignih čvorova i zdravih kontrola.Analiza obogaćivanja puteva otkrila je da su abnormalni metabolizam triptofana i glukoze uobičajene promjene u adenokarcinomu pluća u usporedbi s benignim čvorovima i zdravim kontrolama.Konačno, uspostavili smo i potvrdili serumski metabolički klasifikator s visokom specifičnošću i osjetljivošću za razlikovanje malignih i benignih plućnih čvorova otkrivenih LDCT-om, što može pomoći u ranoj diferencijalnoj dijagnozi i procjeni rizika.
U trenutnoj studiji, uzorci seruma koji odgovaraju spolu i dobi su retrospektivno prikupljeni od 174 zdrave kontrolne skupine, 292 pacijenta sa benignim plućnim nodulima i 229 pacijenata sa stadijumom I plućnog adenokarcinoma.Demografske karakteristike 695 ispitanika prikazane su u Dodatnoj tabeli 1.
Kao što je prikazano na slici 1a, ukupno 480 uzoraka seruma, uključujući 174 zdrave kontrole (HC), 170 benignih čvorova (BN) i 136 uzoraka adenokarcinoma pluća I faze (LA), prikupljeno je u Centru za rak Univerziteta Sun Yat-sen.Kohorta otkrića za neciljano metabolomsko profiliranje pomoću tečne hromatografije ultra-performanse-masene spektrometrije visoke rezolucije (UPLC-HRMS).Kao što je prikazano na dodatnoj slici 1, identificirani su diferencijalni metaboliti između LA i HC, LA i BN kako bi se uspostavio model klasifikacije i dalje istražila analiza diferencijalnog puta.104 uzorka koje je prikupio Univerzitetski centar za rak Sun Yat-sen i 111 uzoraka prikupljenih u dvije druge bolnice podvrgnuti su internoj i eksternoj validaciji, respektivno.
a Studijska populacija u kohorti otkrića koja je podvrgnuta globalnoj serumskoj metabolomičkoj analizi korištenjem tečne hromatografije ultra-performanse - masene spektrometrije visoke rezolucije (UPLC-HRMS).b Parcijalna diskriminantna analiza najmanjih kvadrata (PLS-DA) ukupnog metaboloma 480 uzoraka seruma iz ispitivane kohorte, uključujući zdrave kontrole (HC, n = 174), benigne čvorove (BN, n = 170) i stadijum I adenokarcinoma pluća (Los Angeles, n = 136).+ESI, pozitivni način jonizacije elektrosprejom, -ESI, negativni način jonizacije elektrosprejom.c–e Metaboliti sa značajno različitom zastupljenošću u dvije date grupe (dvostrani Wilcoxon signed rank test, lažna stopa otkrića prilagođena p vrijednost, FDR <0,05) prikazani su crvenom bojom (promjena puta > 1,2) i plavom (promjena puta < 0,83) .) prikazano na grafici vulkana.f Hijerarhijska klasterska toplotna mapa koja pokazuje značajne razlike u broju označenih metabolita između LA i BN.Izvorni podaci se pružaju u obliku datoteka izvornih podataka.
Ukupni serumski metabolom 174 HC, 170 BN i 136 LA u grupi otkrića analiziran je korištenjem UPLC-HRMS analize.Prvo pokazujemo da su uzorci kontrole kvaliteta (QC) čvrsto grupirani u centru nenadziranog modela analize glavnih komponenti (PCA), potvrđujući stabilnost performansi trenutne studije (dodatna slika 2).
Kao što je prikazano u analizi parcijalne diskriminacije najmanjih kvadrata (PLS-DA) na slici 1b, otkrili smo da postoje jasne razlike između LA i BN, LA i HC u pozitivnom (+ESI) i negativnom (-ESI) elektrosprej ionizaciji. .izolovan.Međutim, nisu nađene značajne razlike između BN i HC u +ESI i -ESI uslovima.
Pronašli smo 382 diferencijalne karakteristike između LA i HC, 231 diferencijalne karakteristike između LA i BN i 95 diferencijalnih karakteristika između BN i HC (Wilcoxon signed rank test, FDR <0,05 i višestruke promjene >1,2 ili <0,83) (Slika .1c-e )..Vrhovi su dodatno označeni (dodatni podaci 3) u bazi podataka (mzCloud/HMDB/Chemspider biblioteka) pomoću m/z vrijednosti, vremena zadržavanja i pretraživanja masenog spektra fragmentacije (detalji opisani u odjeljku Metode) 22 .Konačno, 33 i 38 označenih metabolita sa značajnim razlikama u obilju identificirani su za LA naspram BN (slika 1f i dodatna tabela 2) i LA naspram HC (dodatna slika 3 i dopunska tabela 2), respektivno.Nasuprot tome, samo 3 metabolita sa značajnim razlikama u obilju identificirana su u BN i HC (dodatna tabela 2), što je u skladu s preklapanjem između BN i HC u PLS-DA.Ovi diferencijalni metaboliti pokrivaju širok spektar biokemikalija (dopunska slika 4).Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju značajne promjene u serumskom metabolomu koje odražavaju malignu transformaciju raka pluća u ranom stadijumu u poređenju sa benignim plućnim čvorovima ili zdravim subjektima.U međuvremenu, sličnost serumskog metaboloma BN i HC sugerira da benigni plućni noduli mogu dijeliti mnoge biološke karakteristike sa zdravim osobama.S obzirom na to da su mutacije gena receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) česte u podtipu 23 adenokarcinoma pluća, pokušali smo utvrditi utjecaj mutacija pokretača na serumski metabolom.Zatim smo analizirali ukupni metabolomski profil 72 slučaja sa EGFR statusom u grupi sa adenokarcinomom pluća.Zanimljivo je da smo pronašli uporedive profile između pacijenata s mutiranim EGFR (n = 41) i pacijenata divljeg tipa EGFR (n = 31) u PCA analizi (dodatna slika 5a).Međutim, identificirali smo 7 metabolita čija je brojnost značajno izmijenjena kod pacijenata sa EGFR mutacijom u poređenju sa pacijentima sa divljim tipom EGFR (t test, p < 0,05 i kratka promjena > 1,2 ili < 0,83) (dodatna slika 5b).Većina ovih metabolita (5 od 7) su acilkarnitini, koji igraju važnu ulogu u putevima oksidacije masnih kiselina.
Kao što je ilustrovano u toku rada prikazanom na Slici 2 a, biomarkeri za klasifikaciju nodula su dobijeni korišćenjem operatora najmanjeg apsolutnog skupljanja i selekcije na osnovu 33 diferencijalna metabolita identifikovana u LA (n = 136) i BN (n = 170).Najbolja kombinacija varijabli (LASSO) – binarni logistički regresijski model.Za testiranje pouzdanosti modela korištena je deseterostruka unakrsna validacija.Odabir varijable i regularizacija parametara se prilagođavaju kaznom maksimizacije vjerovatnoće s parametrom λ24.Globalna metabolomička analiza je dalje sprovedena nezavisno u grupama za internu validaciju (n = 104) i eksternu validaciju (n = 111) da bi se testirala performansa klasifikacije diskriminantnog modela.Kao rezultat, 27 metabolita u skupu otkrića identifikovano je kao najbolji diskriminantni model sa najvećom srednjom vrednošću AUC (slika 2b), među kojima je 9 imalo povećanu aktivnost, a 18 smanjenu aktivnost u LA u poređenju sa BN (slika 2c).
Tijek rada za izgradnju klasifikatora plućnih nodula, uključujući odabir najboljeg panela serumskih metabolita u setu za otkrivanje koristeći binarni logistički regresijski model putem desetostruke unakrsne validacije i procjenu prediktivnih performansi u setovima za internu i eksternu validaciju.b Statistika unakrsne validacije LASSO regresijskog modela za odabir metaboličkih biomarkera.Gore navedeni brojevi predstavljaju prosječan broj biomarkera odabranih na datom λ.Crvena isprekidana linija predstavlja prosječnu vrijednost AUC na odgovarajućoj lambdi.Sive trake greške predstavljaju minimalne i maksimalne vrijednosti AUC.Isprekidana linija označava najbolji model sa 27 odabranih biomarkera.AUC, površina ispod krive radne karakteristike prijemnika (ROC).c Promjene 27 odabranih metabolita u LA grupi u poređenju sa BN grupom u grupi koja je otkrila.Crveni stupac – aktivacija.Plava kolona je pad.d–f Krive radne karakteristike prijemnika (ROC) koje pokazuju snagu diskriminantnog modela zasnovanog na 27 kombinacija metabolita u setovima za otkrivanje, internu i eksternu validaciju.Izvorni podaci se pružaju u obliku datoteka izvornih podataka.
Model predviđanja je kreiran na osnovu ponderisanih koeficijenata regresije ovih 27 metabolita (dodatna tabela 3).ROC analiza zasnovana na ovih 27 metabolita dala je vrijednost površine ispod krive (AUC) od 0,933, osjetljivost grupe otkrića bila je 0,868, a specifičnost 0,859 (slika 2d).U međuvremenu, među 38 označenih diferencijalnih metabolita između LA i HC, skup od 16 metabolita postigao je AUC od 0,902 sa osjetljivošću od 0,801 i specifičnošću od 0,856 u razlikovanju LA od HC (dodatna slika 6a-c).Također su uspoređene vrijednosti AUC zasnovane na različitim pragovima promjene puta za različite metabolite.Otkrili smo da se model klasifikacije najbolje pokazao u razlikovanju između LA i BN (HC) kada je nivo promjene nabora postavljen na 1,2 naspram 1,5 ili 2,0 (dodatna slika 7a,b).Model klasifikacije, zasnovan na 27 grupa metabolita, dodatno je potvrđen u internim i eksternim kohortama.AUC je bio 0,915 (osjetljivost 0,867, specifičnost 0,811) za internu validaciju i 0,945 (osjetljivost 0,810, specifičnost 0,979) za eksternu validaciju (slika 2e, f).Da bi se procijenila međulaboratorijska efikasnost, 40 uzoraka iz eksterne kohorte analizirano je u vanjskoj laboratoriji kao što je opisano u odjeljku Metode.Preciznost klasifikacije je postigla AUC od 0,925 (dodatna slika 8).Budući da je karcinom skvamoznih stanica pluća (LUSC) drugi najčešći podtip raka pluća ne-malih stanica (NSCLC) nakon adenokarcinoma pluća (LUAD), također smo testirali validiranu potencijalnu korisnost metaboličkih profila.BN i 16 slučajeva LUSC.AUC diskriminacije između LUSC i BN bio je 0,776 (dopunska slika 9), što ukazuje na lošiju sposobnost u poređenju sa diskriminacijom između LUAD i BN.
Studije su pokazale da je veličina čvorova na CT snimcima u pozitivnoj korelaciji s vjerovatnoćom maligniteta i ostaje glavna determinanta liječenja nodula25,26,27.Analiza podataka iz velike grupe NELSON skrining studije pokazala je da je rizik od maligniteta kod ispitanika sa čvorovima <5 mm bio čak sličan onom kod ispitanika bez čvorova 28 .Prema tome, minimalna veličina koja zahtijeva redovno CT praćenje je 5 mm, prema preporuci British Thoracic Society (BTS), i 6 mm, prema preporuci Fleischner Society 29 .Međutim, čvorovi veći od 6 mm i bez očiglednih benignih karakteristika, koji se nazivaju neodređeni plućni noduli (IPN), ostaju glavni izazov u evaluaciji i zbrinjavanju u kliničkoj praksi30,31.Zatim smo ispitali da li veličina nodula utječe na metabolomske potpise koristeći objedinjene uzorke iz kohorti otkrića i interne validacije.Fokusirajući se na 27 validiranih biomarkera, prvo smo uporedili PCA profile metaboloma HC i BN ispod 6 mm.Otkrili smo da se većina tačaka podataka za HC i BN preklapa, pokazujući da su nivoi metabolita u serumu bili slični u obe grupe (slika 3a).Karte karakteristika u različitim rasponima veličina ostale su očuvane u BN i LA (slika 3b, c), dok je uočeno razdvajanje između malignih i benignih čvorova u rasponu od 6-20 mm (slika 3d).Ova kohorta je imala AUC od 0,927, specifičnost od 0,868 i osjetljivost od 0,820 za predviđanje maligniteta čvorova veličine 6 do 20 mm (slika 3e, f).Naši rezultati pokazuju da klasifikator može obuhvatiti metaboličke promjene uzrokovane ranom malignom transformacijom, bez obzira na veličinu nodula.
ad Poređenje PCA profila između određenih grupa na osnovu metaboličkog klasifikatora od 27 metabolita.CC i BN < 6 mm.b BN < 6 mm naspram BN 6–20 mm.u LA 6–20 mm naspram LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm i LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Kriva radne karakteristike prijemnika (ROC) koja pokazuje performanse diskriminantnog modela za nodule 6–20 mm.f Vrijednosti vjerovatnoće su izračunate na osnovu modela logističke regresije za nodule veličine 6-20 mm.Siva isprekidana linija predstavlja optimalnu graničnu vrijednost (0,455).Gore navedeni brojevi predstavljaju procenat slučajeva predviđenih za Los Angeles.Koristite dvostrani Studentov t test.PCA, analiza glavnih komponenti.AUC površina ispod krive.Izvorni podaci se pružaju u obliku datoteka izvornih podataka.
Četiri uzorka (starosti 44-61 godina) sa sličnim veličinama plućnih nodula (7-9 mm) su dalje odabrana da ilustruju performanse predloženog modela predviđanja maligniteta (Sl. 4a, b).Na početnom skriningu, Slučaj 1 je predstavljen kao čvrsti čvor sa kalcifikacijama, karakteristika povezana sa benignošću, dok je Slučaj 2 predstavljen kao neodređeni djelomično čvrst čvor bez očiglednih benignih karakteristika.Tri runde naknadnih CT skeniranja su pokazale da su ovi slučajevi ostali stabilni tokom perioda od 4 godine i stoga se smatraju benignim nodulima (slika 4a).U poređenju sa kliničkom evaluacijom serijskih CT skeniranja, analiza metabolita seruma pojedinačnih injekcija sa trenutnim modelom klasifikatora brzo je i ispravno identifikovala ove benigne čvorove na osnovu verovatnoća ograničenja (Tabela 1).Na slici 4b u slučaju 3 prikazan je nodul sa znacima pleuralne retrakcije, što je najčešće udruženo sa malignitetom32.Slučaj 4 predstavljen je kao neodređeni djelomično čvrst čvor bez dokaza o benignom uzroku.Svi ovi slučajevi su predviđeni kao maligni prema modelu klasifikatora (Tabela 1).Procjena adenokarcinoma pluća je demonstrirana histopatološkim pregledom nakon operacije resekcije pluća (slika 4b).Za skup eksterne validacije, metabolički klasifikator je tačno predvideo dva slučaja neodređenih plućnih nodula većih od 6 mm (dodatna slika 10).
CT slike aksijalnog prozora pluća dva slučaja benignih nodula.U slučaju 1, CT snimak nakon 4 godine pokazao je stabilan čvrsti nodul veličine 7 mm sa kalcifikacijama u desnom donjem režnju.U slučaju 2, CT skeniranje nakon 5 godina otkrilo je stabilan, djelomično čvrst čvor promjera 7 mm u desnom gornjem režnju.b Aksijalni prozor CT slike pluća i odgovarajuće patološke studije dva slučaja adenokarcinoma stadijuma I pre resekcije pluća.U slučaju 3 otkriven je čvor prečnika 8 mm u desnom gornjem režnju sa pleuralnom retrakcijom.Slučaj 4 otkrio je djelomično čvrst čvorić od brušenog stakla veličine 9 mm u lijevom gornjem režnju.Bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E) reseciranog plućnog tkiva (skala bar = 50 μm) pokazuje acinarni obrazac rasta adenokarcinoma pluća.Strelice pokazuju nodule otkrivene na CT snimcima.H&E slike su reprezentativne slike više (>3) mikroskopskih polja koje pregleda patolog.
Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju potencijalnu vrijednost biomarkera metabolita u serumu u diferencijalnoj dijagnozi plućnih nodula, što može predstavljati izazov pri evaluaciji CT skrininga.
Na osnovu validiranog panela diferencijalnih metabolita, nastojali smo da identifikujemo biološke korelate glavnih metaboličkih promena.Analiza obogaćivanja KEGG puteva od strane MetaboAnalysta identifikovala je 6 uobičajenih značajno izmenjenih puteva između dve date grupe (LA naspram HC i LA naspram BN, prilagođeno p ≤ 0,001, efekat > 0,01).Ove promjene karakteriziraju poremećaji metabolizma piruvata, metabolizma triptofana, metabolizma niacina i nikotinamida, glikolize, TCA ciklusa i metabolizma purina (slika 5a).Zatim smo dalje izvršili ciljanu metabolomiku kako bismo potvrdili velike promjene koristeći apsolutnu kvantifikaciju.Određivanje uobičajenih metabolita u često promijenjenim putevima pomoću trostruke kvadrupolne masene spektrometrije (QQQ) koristeći autentične standarde metabolita.Demografske karakteristike ciljnog uzorka metabolomske studije uključene su u dopunsku tabelu 4. U skladu sa našim globalnim rezultatima metabolomike, kvantitativna analiza je potvrdila da su hipoksantin i ksantin, piruvat i laktat povećani u LA u poređenju sa BN i HC (sl. 5b, c, p <0,05).Međutim, nisu nađene značajne razlike u ovim metabolitima između BN i HC.
Analiza KEGG puta obogaćivanja značajno različitih metabolita u LA grupi u poređenju sa BN i HC grupama.Korišten je dvostrani Globaltest, a p vrijednosti su podešene pomoću Holm-Bonferronijeve metode (prilagođeno p ≤ 0,001 i veličina efekta > 0,01).b–d Violin grafikoni koji pokazuju nivoe hipoksantina, ksantina, laktata, piruvata i triptofana u serumu HC, BN i LA određene pomoću LC-MS/MS (n = 70 po grupi).Bijele i crne isprekidane linije označavaju medijan i kvartil, respektivno.e Violin grafikon koji prikazuje normalizovanu Log2TPM (transkripti na milion) mRNA ekspresije SLC7A5 i QPRT u adenokarcinomu pluća (n = 513) u poređenju sa normalnim plućnim tkivom (n = 59) u LUAD-TCGA skupu podataka.Bijela kutija predstavlja interkvartilni raspon, vodoravna crna linija u centru predstavlja medijanu, a vertikalna crna linija koja se proteže od okvira predstavlja interval pouzdanosti od 95% (CI).f Pirsonova korelacija ekspresije SLC7A5 i GAPDH u adenokarcinomu pluća (n = 513) i normalnom plućnom tkivu (n = 59) u skupu podataka TCGA.Siva zona predstavlja 95% CI.r, Pirsonov koeficijent korelacije.g Normalizovani nivoi ćelijskog triptofana u A549 ćelijama transficiranim nespecifičnom shRNA kontrolom (NC) i shSLC7A5 (Sh1, Sh2) utvrđenim pomoću LC-MS/MS.Prikazana je statistička analiza pet biološki nezavisnih uzoraka u svakoj grupi.h Ćelijski nivoi NADt (ukupni NAD, uključujući NAD+ i NADH) u A549 ćelijama (NC) i SLC7A5 srušenim A549 ćelijama (Sh1, Sh2).Prikazana je statistička analiza tri biološki nezavisna uzorka u svakoj grupi.i Glikolitička aktivnost A549 ćelija prije i nakon uništavanja SLC7A5 mjerena je brzinom ekstracelularne acidifikacije (ECAR) (n = 4 biološki nezavisna uzorka po grupi).2-DG,2-deoksi-D-glukoza.Dvostrani Studentov t test je korišten u (b–h).U (g–i), trake greške predstavljaju srednju vrijednost ± SD, svaki eksperiment je izveden tri puta nezavisno i rezultati su bili slični.Izvorni podaci se pružaju u obliku datoteka izvornih podataka.
Uzimajući u obzir značajan uticaj izmenjenog metabolizma triptofana u LA grupi, takođe smo procenili nivoe triptofana u serumu u HC, BN i LA grupama koristeći QQQ.Otkrili smo da je triptofan u serumu smanjen u LA u poređenju sa HC ili BN (p < 0,001, Slika 5d), što je u skladu s prethodnim nalazima da su razine triptofana u cirkulaciji niže kod pacijenata s karcinomom pluća nego u zdravih kontrola iz kontrolne grupe33,34 ,35.Druga studija koja je koristila PET/CT tragač 11C-metil-L-triptofana otkrila je da je vrijeme zadržavanja signala triptofana u tkivu raka pluća značajno povećano u poređenju s benignim lezijama ili normalnim tkivom36.Pretpostavljamo da smanjenje triptofana u LA serumu može odražavati aktivni unos triptofana od strane stanica raka pluća.
Također je poznato da je krajnji proizvod kinurenin puta katabolizma triptofana NAD+37,38, koji je važan supstrat za reakciju gliceraldehid-3-fosfata sa 1,3-bisfosfogliceratom u glikolizi39.Dok su se prethodne studije fokusirale na ulogu katabolizma triptofana u imunološkoj regulaciji, nastojali smo razjasniti interakciju između disregulacije triptofana i glikolitičkih puteva uočenih u ovoj studiji.Poznato je da je 7-člana porodica transportera rastvorenih materija (SLC7A5) transporter triptofana43,44,45.Fosforiboziltransferaza kinolinske kiseline (QPRT) je enzim koji se nalazi nizvodno od kinurenin puta koji pretvara kinolinsku kiselinu u NAMN46.Inspekcija LUAD TCGA skupa podataka otkrila je da su i SLC7A5 i QPRT značajno povećani u tumorskom tkivu u poređenju sa normalnim tkivom (slika 5e).Ovo povećanje je uočeno u stadijumima I i II, kao i stadijumima III i IV adenokarcinoma pluća (dopunska slika 11), što ukazuje na rane poremećaje u metabolizmu triptofana povezane sa tumorigenezom.
Dodatno, LUAD-TCGA skup podataka pokazao je pozitivnu korelaciju između ekspresije mRNA SLC7A5 i GAPDH u uzorcima pacijenata oboljelih od raka (r = 0,45, p = 1,55E-26, slika 5f).Nasuprot tome, nije pronađena značajna korelacija između ovakvih genskih potpisa u normalnom plućnom tkivu (r = 0,25, p = 0,06, slika 5f).Obaranje SLC7A5 (dopunska slika 12) u A549 ćelijama značajno je smanjilo nivoe ćelijskog triptofana i NAD(H) (slika 5g,h), što je rezultiralo oslabljenom glikolitičkom aktivnošću mjerenom ekstracelularnom brzinom acidifikacije (ECAR) (slika 1).5i).Stoga, na osnovu metaboličkih promjena u serumu i in vitro detekcije, pretpostavljamo da metabolizam triptofana može proizvesti NAD+ putem kinureninskog puta i igrati važnu ulogu u promicanju glikolize kod raka pluća.
Studije su pokazale da veliki broj neodređenih plućnih čvorova otkrivenih LDCT-om može dovesti do potrebe za dodatnim testiranjem kao što su PET-CT, biopsija pluća i pretjerano liječenje zbog lažno pozitivne dijagnoze maligniteta.31 Kao što je prikazano na slici 6, naša studija je identifikovala panel serumskih metabolita sa potencijalnom dijagnostičkom vrednošću koji mogu poboljšati stratifikaciju rizika i naknadno zbrinjavanje plućnih čvorova otkrivenih CT-om.
Plućni čvorovi se procjenjuju korištenjem kompjuterizovane tomografije malih doza (LDCT) sa slikovnim karakteristikama koje upućuju na benigne ili maligne uzroke.Nesiguran ishod nodula može dovesti do čestih kontrolnih posjeta, nepotrebnih intervencija i pretjeranog liječenja.Uključivanje serumskih metaboličkih klasifikatora sa dijagnostičkom vrijednošću može poboljšati procjenu rizika i naknadno liječenje plućnih nodula.PET pozitronska emisiona tomografija.
Podaci iz američke NLST studije i evropske NELSON studije sugeriraju da skrining grupa visokog rizika s niskom dozom kompjuterizovane tomografije (LDCT) može smanjiti smrtnost od raka pluća1,3.Međutim, procjena rizika i naknadno kliničko liječenje velikog broja slučajnih plućnih nodula otkrivenih LDCT-om ostaju najizazovniji.Glavni cilj je optimizirati ispravnu klasifikaciju postojećih protokola zasnovanih na LDCT-u ugradnjom pouzdanih biomarkera.
Određeni molekularni biomarkeri, kao što su metaboliti u krvi, identificirani su poređenjem raka pluća sa zdravim kontrolama15,17.U trenutnoj studiji, fokusirali smo se na primjenu analize serumske metabolomike kako bismo razlikovali benigne i maligne plućne nodule slučajno otkrivene LDCT-om.Uporedili smo globalni serumski metabolom zdravih kontrolnih uzoraka (HC), benignih plućnih čvorova (BN) i stadijuma I plućnog adenokarcinoma (LA) koristeći UPLC-HRMS analizu.Otkrili smo da HC i BN imaju slične metaboličke profile, dok je LA pokazao značajne promjene u poređenju sa HC i BN.Identificirali smo dva skupa serumskih metabolita koji razlikuju LA od HC i BN.
Trenutna šema identifikacije benignih i malignih čvorova zasnovana na LDCT-u uglavnom se zasniva na veličini, gustoći, morfologiji i brzini rasta nodula tokom vremena30.Prethodne studije su pokazale da je veličina nodula usko povezana s vjerovatnoćom raka pluća.Čak i kod visokorizičnih pacijenata, rizik od maligniteta u čvorovima <6 mm je <1%.Rizik od maligniteta za čvorove veličine 6 do 20 mm kreće se od 8% do 64%30.Stoga, Fleischner Society preporučuje granični prečnik od 6 mm za rutinsko CT praćenje.29 Međutim, procjena rizika i zbrinjavanje neodređenih plućnih nodula (IPN) većih od 6 mm nisu adekvatno obavljeni 31 .Trenutni tretman kongenitalne srčane bolesti obično se zasniva na pažljivom čekanju uz česte CT praćenje.
Na osnovu validiranog metaboloma, po prvi put smo pokazali preklapanje metabolomskih potpisa između zdravih osoba i benignih čvorova <6 mm.Biološka sličnost je u skladu s prethodnim CT nalazima da je rizik od maligniteta za čvorove <6 mm jednako nizak kao i za subjekte bez čvorova.30 Treba napomenuti da naši rezultati također pokazuju da benigni noduli <6 mm i ≥6 mm imaju visoke sličnost metabolomskih profila, što sugerira da je funkcionalna definicija benigne etiologije konzistentna bez obzira na veličinu nodula.Stoga, moderni dijagnostički paneli metabolita u serumu mogu pružiti jedan test kao test za isključenje kada se čvorovi inicijalno otkriju na CT-u i potencijalno smanjuju serijski monitoring.U isto vrijeme, isti panel metaboličkih biomarkera razlikovao je maligne čvorove veličine ≥6 mm od benignih čvorova i pružio precizna predviđanja za IPN slične veličine i dvosmislenih morfoloških karakteristika na CT snimcima.Ovaj klasifikator serumskog metabolizma pokazao se dobro u predviđanju maligniteta čvorova ≥6 mm sa AUC od 0,927.Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da jedinstveni metabolomski potpisi u serumu mogu specifično odražavati rane metaboličke promjene izazvane tumorom i da imaju potencijalnu vrijednost kao prediktori rizika, neovisno o veličini čvorića.
Posebno, adenokarcinom pluća (LUAD) i karcinom skvamoznih ćelija (LUSC) su glavni tipovi karcinoma ne-malih ćelija pluća (NSCLC).S obzirom da je LUSC snažno povezan s upotrebom duhana47 i LUAD je najčešća histologija slučajnih plućnih nodula otkrivenih na CT skriningu48, naš model klasifikatora je posebno napravljen za uzorke adenokarcinoma u stadiju I.Wang i kolege su se također fokusirali na LUAD i identificirali devet lipidnih potpisa koristeći lipidomiku za razlikovanje raka pluća u ranoj fazi od zdravih osoba17.Testirali smo trenutni model klasifikatora na 16 slučajeva faze I LUSC i 74 benigna čvora i uočili nisku tačnost predviđanja LUSC-a (AUC 0,776), što sugerira da LUAD i LUSC mogu imati vlastite metabolomske potpise.Zaista se pokazalo da se LUAD i LUSC razlikuju po etiologiji, biološkom porijeklu i genetskim aberacijama49.Stoga bi druge vrste histologije trebale biti uključene u modele obuke za detekciju karcinoma pluća na bazi populacije u programima skrininga.
Ovdje smo identificirali šest najčešće izmijenjenih puteva u adenokarcinomu pluća u poređenju sa zdravim kontrolama i benignim čvorovima.Ksantin i hipoksantin su uobičajeni metaboliti metaboličkog puta purina.U skladu s našim rezultatima, međuprodukti povezani s metabolizmom purina su značajno povećani u serumu ili tkivima pacijenata sa adenokarcinomom pluća u usporedbi sa zdravim kontrolama ili pacijentima u preinvazivnom stadiju15,50.Povišeni nivoi ksantina i hipoksantina u serumu mogu odražavati anabolizam koji je potreban za brzo proliferirajuće ćelije raka.Disregulacija metabolizma glukoze je dobro poznato obeležje metabolizma raka51.Ovdje smo primijetili značajno povećanje piruvata i laktata u LA grupi u poređenju sa HC i BN grupom, što je u skladu s prethodnim izvještajima o abnormalnostima glikolitičkog puta u profilima serumskog metaboloma pacijenata s karcinomom ne-malih stanica pluća (NSCLC) i zdrave kontrole.rezultati su konzistentni52,53.
Važno je da smo uočili inverznu korelaciju između metabolizma piruvata i triptofana u serumu adenokarcinoma pluća.Nivoi triptofana u serumu su smanjeni u LA grupi u poređenju sa HC ili BN grupom.Zanimljivo je da je prethodna velika studija koja je koristila prospektivnu kohortu otkrila da su niske razine cirkulirajućeg triptofana povezane s povećanim rizikom od raka pluća 54 .Triptofan je esencijalna aminokiselina koju u potpunosti dobivamo hranom.Zaključujemo da nedostatak triptofana u serumu kod adenokarcinoma pluća može odražavati brzo iscrpljivanje ovog metabolita.Dobro je poznato da je krajnji proizvod katabolizma triptofana putem kinureninskog puta izvor de novo sinteze NAD+.Budući da se NAD+ proizvodi prvenstveno putem spašavanja, važnost NAD+ u metabolizmu triptofana u zdravlju i bolesti ostaje da se utvrdi46.Naša analiza TCGA baze podataka pokazala je da je ekspresija transportera otopljene tvari triptofana 7A5 (SLC7A5) značajno povećana kod adenokarcinoma pluća u poređenju sa normalnim kontrolama i da je u pozitivnoj korelaciji sa ekspresijom glikolitičkog enzima GAPDH.Prethodne studije su se uglavnom fokusirale na ulogu katabolizma triptofana u suzbijanju antitumorskog imunološkog odgovora40,41,42.Ovdje pokazujemo da inhibicija uzimanja triptofana uništavanjem SLC7A5 u ćelijama raka pluća rezultira naknadnim smanjenjem ćelijskih nivoa NAD i pratećim slabljenjem glikolitičke aktivnosti.Ukratko, naša studija pruža biološku osnovu za promjene u metabolizmu seruma povezane sa malignom transformacijom adenokarcinoma pluća.
EGFR mutacije su najčešće mutacije pokretača kod pacijenata sa NSCLC.U našoj studiji smo otkrili da pacijenti sa mutacijom EGFR (n = 41) imaju ukupne metabolomske profile slične pacijentima sa divljim tipom EGFR (n = 31), iako smo otkrili smanjene serumske razine nekih pacijenata s mutiranim EGFR kod pacijenata s acilkarnitinom.Ustanovljena funkcija acilkarnitina je transport acilnih grupa iz citoplazme u mitohondrijski matriks, što dovodi do oksidacije masnih kiselina za proizvodnju energije 55 .U skladu sa našim nalazima, nedavna studija je takođe identifikovala slične profile metaboloma između EGFR mutanta i tumora divljeg tipa EGFR analizom globalnog metaboloma 102 uzorka tkiva adenokarcinoma pluća50.Zanimljivo je da je sadržaj acilkarnitina također pronađen u EGFR mutantnoj grupi.Stoga, da li promjene u razinama acilkarnitina odražavaju metaboličke promjene izazvane EGFR-om i osnovnim molekularnim putevima može zavrijediti dalje istraživanje.
U zaključku, naša studija uspostavlja serumski metabolički klasifikator za diferencijalnu dijagnozu plućnih čvorova i predlaže tok rada koji može optimizirati procjenu rizika i olakšati kliničko upravljanje na osnovu CT skrininga.
Ovu studiju odobrili su Etički komitet Univerzitetske bolnice za rak Sun Yat-sen, Prva pridružena bolnica Univerziteta Sun Yat-sen i Etički komitet Univerzitetske bolnice za rak Univerziteta Zhengzhou.U grupama za otkrivanje i internu validaciju, prikupljeno je 174 seruma od zdravih osoba i 244 seruma iz benignih nodula od pojedinaca koji su bili podvrgnuti godišnjim medicinskim pregledima u Odjelu za kontrolu i prevenciju raka, Univerzitetski centar za rak Sun Yat-sen i 166 benignih nodula.serum.Adenokarcinomi u stadiju I prikupljeni su iz Centra za rak Univerziteta Sun Yat-sen.U kohorti eksterne validacije bilo je 48 slučajeva benignih nodula, 39 slučajeva adenokarcinoma pluća I stadijuma iz Prve pridružene bolnice Univerziteta Sun Yat-sen i 24 slučaja adenokarcinoma I stadijuma pluća iz bolnice za rak u Žengdžou.Univerzitetski centar za rak Sun Yat-sen je također prikupio 16 slučajeva raka pluća I stadija skvamoznih stanica kako bi testirao dijagnostičku sposobnost uspostavljenog metaboličkog klasifikatora (karakteristike pacijenata prikazane su u Dodatnoj tabeli 5).Uzorci iz kohorte otkrića i kohorte interne validacije prikupljeni su između januara 2018. i maja 2020. Uzorci za kohortu eksterne validacije prikupljeni su između avgusta 2021. i oktobra 2022. Da bi se pristrasnost polova svela na najmanju moguću mjeru, približno jednak broj muških i ženskih slučajeva dodijeljen je svakom kohorta.Tim za otkrivanje i Tim za internu reviziju.Pol učesnika je određen na osnovu samoprijave.Informisani pristanak je dobijen od svih učesnika i nikakva kompenzacija nije obezbijeđena.Subjekti sa benignim čvorovima bili su oni sa stabilnim rezultatom CT skeniranja u periodu od 2 do 5 godina u vrijeme analize, osim 1 slučaja iz uzorka za eksternu validaciju, koji je sakupljen prije operacije i dijagnosticiran histopatološki.Osim hroničnog bronhitisa.Slučajevi adenokarcinoma pluća prikupljeni su prije resekcije pluća i potvrđeni patološkom dijagnozom.Uzorci krvi natašte su sakupljeni u epruvete za odvajanje seruma bez ikakvih antikoagulansa.Uzorci krvi su zgrušavani 1 sat na sobnoj temperaturi, a zatim centrifugirani na 2851 × g 10 minuta na 4°C da bi se sakupio supernatant seruma.Alikvoti seruma su zamrznuti na -80°C do ekstrakcije metabolita.Odjel za prevenciju raka i medicinski pregled Centra za rak Univerziteta Sun Yat-sen prikupio je zbir seruma od 100 zdravih davalaca, uključujući jednak broj muškaraca i žena u dobi od 40 do 55 godina.Pomiješane su jednake količine uzorka svakog donora, dobiveni bazen je alikvotan i pohranjen na -80°C.Smjesa seruma je korištena kao referentni materijal za kontrolu kvaliteta i standardizaciju podataka.
Referentni serum i uzorci testa su odmrznuti, a metaboliti ekstrahovani kombinovanom metodom ekstrakcije (MTBE/metanol/voda) 56 .Ukratko, 50 μl seruma je pomiješano sa 225 μl ledeno hladnog metanola i 750 μl ledeno hladnog metil terc-butil etera (MTBE).Promiješajte smjesu i inkubirajte na ledu 1 sat.Uzorci su zatim pomiješani i vorteksom pomiješani sa 188 μl MS vode koja sadrži interne standarde (13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metionin i 13C6-izoleucin, kupljene od Cambridge Isotop Laboratories).Smjesa je zatim centrifugirana na 15.000 × g 10 minuta na 4 °C, a donja faza je prebačena u dvije epruvete (125 μL svaka) za LC-MS analizu u pozitivnom i negativnom modusu.Konačno, uzorak je uparen do suha u vakuumskom koncentratoru velike brzine.
Osušeni metaboliti su rekonstituisani u 120 μl 80% acetonitrila, vorteksirani 5 minuta i centrifugirani na 15.000 × g 10 minuta na 4°C.Supernatanti su prebačeni u bočice od žutog stakla sa mikroumetcima za metabolomičke studije.Analiza neciljane metabolomike na platformi tečne hromatografije ultra-performanse i masene spektrometrije visoke rezolucije (UPLC-HRMS).Metaboliti su razdvojeni pomoću Dionex Ultimate 3000 UPLC sistema i ACQUITY BEH Amide kolone (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).U režimu pozitivnih jona, mobilne faze su bile 95% (A) i 50% acetonitrila (B), a svaka je sadržavala 10 mmol/L amonijum acetata i 0,1% mravlje kiseline.U negativnom režimu, mobilne faze A i B sadržavale su 95% i 50% acetonitrila, respektivno, obe faze su sadržavale 10 mmol/L amonijum acetata, pH = 9. Program gradijenta je bio sledeći: 0–0,5 min, 2% B;0,5–12 min, 2–50% B;12–14 min, 50–98% B;14–16 min, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16,1–20 min, 2% B. Kolona je održavana na 40°C, a uzorak na 10°C u autosampleru.Brzina protoka je bila 0,3 ml/min, zapremina injekcije je bila 3 μl.Q-Exactive Orbitrap maseni spektrometar (Thermo Fisher Scientific) sa izvorom elektrosprej jonizacije (ESI) radio je u režimu punog skeniranja i u kombinaciji sa ddMS2 režimom praćenja kako bi se prikupile velike količine podataka.Parametri MS-a su postavljeni na sledeći način: napon raspršivanja +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatura kapilara 320°C, zaštitni gas 40 arb, pomoćni gas 10 arb, temperatura grejača sonde 350°C, opseg skeniranja 70-1050 m/h, rezoluciju.70 000. Podaci su prikupljeni korištenjem Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Za procjenu kvaliteta podataka, prikupljeni su uzorci za kontrolu kvaliteta (QC) uklanjanjem alikvota od 10 μL supernatanta iz svakog uzorka.Šest ubrizgavanja uzoraka kontrole kvaliteta analizirano je na početku analitičke sekvence kako bi se procijenila stabilnost UPLC-MS sistema.Uzorci kontrole kvaliteta se zatim periodično unose u seriju.Svih 11 serija uzoraka seruma u ovoj studiji analizirano je LC-MS.Alikvoti mešavine seruma od 100 zdravih donora korišćeni su kao referentni materijal u odgovarajućim serijama za praćenje procesa ekstrakcije i prilagođavanje efekata serije na šaržu.Neciljana metabolomička analiza kohorte otkrića, interne validacijske kohorte i eksterne validacijske kohorte obavljena je u Metabolomics Centru Univerziteta Sun Yat-sen.Eksterna laboratorija Centra za analizu i testiranje Tehnološkog univerziteta Guangdong također je analizirala 40 uzoraka iz eksterne kohorte kako bi testirala performanse modela klasifikatora.
Nakon ekstrakcije i rekonstitucije, izmjerena je apsolutna kvantifikacija serumskih metabolita korištenjem tečne hromatografije ultra-visokih performansi-tandem masene spektrometrije (Agilent 6495 trostruki kvadrupol) sa izvorom jonizacije elektrosprejom (ESI) u režimu praćenja višestrukih reakcija (MRM).Kolona ACQUITY BEH amida (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) je korištena za odvajanje metabolita.Mobilna faza se sastojala od 90% (A) i 5% acetonitrila (B) sa 10 mmol/L amonijum acetata i 0,1% rastvora amonijaka.Program gradijenta je bio sljedeći: 0–1,5 min, 0% B;1,5–6,5 min, 0–15% B;6,5–8 min, 15% B;8–8,5 min, 15%–0% B;8,5–11,5 min, 0% B.Kolona je održavana na 40 °C, a uzorak na 10 °C u autosampleru.Brzina protoka je bila 0,3 mL/min, a volumen injekcije 1 μL.MS parametri su postavljeni na sljedeći način: kapilarni napon ±3,5 kV, pritisak raspršivača 35 psi, protok plina u omotaču 12 L/min, temperatura plina u omotaču 350°C, temperatura plina za sušenje 250°C i protok plina za sušenje 14 l/min.MRM konverzije triptofana, piruvata, laktata, hipoksantina i ksantina bile su 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 i 151,0–107.9 respektivno.Podaci su prikupljeni pomoću Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Za uzorke seruma, triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin i ksantin su kvantificirani korištenjem kalibracijskih krivulja otopina standardnih mješavina.Za uzorke ćelija, sadržaj triptofana je normalizovan na interni standard i ćelijsku proteinsku masu.
Ekstrakcija pika (m/z i vrijeme zadržavanja (RT)) izvedena je korištenjem Compound Discovery 3.1 i TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Da bi se eliminisale potencijalne razlike između serija, svaki karakteristični pik testnog uzorka podijeljen je s karakterističnim vrhom referentnog materijala iz iste serije kako bi se dobila relativna količina.Relativna standardna devijacija internih standarda prije i poslije standardizacije prikazana su u Dodatnoj tabeli 6. Razlike između dvije grupe su bile okarakterisane stopom lažnog otkrivanja (FDR<0,05, Wilcoxon signed rank test) i promjenom puta (>1,2 ili <0,83).Sirovi MS podaci ekstrahiranih karakteristika i referentni serumsko korigirani MS podaci prikazani su u Dodatnim podacima 1 i Dodatnim podacima 2, respektivno.Označavanje vrha je izvršeno na osnovu četiri definisana nivoa identifikacije, uključujući identifikovane metabolite, pretpostavljeno označena jedinjenja, pretpostavljeno okarakterisane klase jedinjenja i nepoznata jedinjenja 22 .Na osnovu pretraživanja baze podataka u Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), biološka jedinjenja sa MS/MS odgovarajućim validiranim standardima ili napomenama tačnog podudaranja u mzCloud (score > 85) ili Chemspider konačno su odabrana kao posrednici između diferencijalnog metaboloma.Napomene o vrhuncu za svaku karakteristiku uključene su u Dopunske podatke 3. MetaboAnalyst 5.0 je korišten za univarijantnu analizu zbirno normaliziranog obilja metabolita.MetaboAnalyst 5.0 je takođe procenio analizu obogaćivanja KEGG puta na osnovu značajno različitih metabolita.Analiza glavnih komponenti (PCA) i parcijalna diskriminantna analiza najmanjih kvadrata (PLS-DA) analizirane su korištenjem softverskog paketa ropls (v.1.26.4) sa normalizacijom steka i automatskim skaliranjem.Optimalni model biomarkera metabolita za predviđanje maligniteta čvorova generiran je korištenjem binarne logističke regresije sa najmanjim apsolutnim skupljanjem i operatorom selekcije (LASSO, R paket v.4.1-3).Performanse diskriminantnog modela u setovima za detekciju i validaciju karakterizirana je procjenom AUC na osnovu ROC analize prema pROC paketu (v.1.18.0.).Optimalna granica vjerovatnoće dobijena je na osnovu maksimalnog Youdenovog indeksa modela (osjetljivost + specifičnost – 1).Uzorci sa vrijednostima manjim ili većim od praga bit će predviđeni kao benigni noduli i adenokarcinom pluća, respektivno.
A549 ćelije (#CCL-185, American Type Culture Collection) uzgajane su u F-12K mediju koji sadrži 10% FBS.Kratke RNA sekvence (shRNA) koje ciljaju na SLC7A5 i neciljanu kontrolu (NC) umetnute su u lentivirusni vektor pLKO.1-puro.Antisens sekvence shSLC7A5 su sljedeće: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).Antitela na SLC7A5 (#5347) i tubulin (#2148) su kupljena od Cell Signaling Technology.Antitijela na SLC7A5 i tubulin korištena su u razrjeđenju od 1:1000 za Western blot analizu.
Seahorse XF Glycolytic Stress Test mjeri nivoe ekstracelularne acidifikacije (ECAR).U testu, glukoza, oligomicin A i 2-DG su davani uzastopno kako bi se testirao ćelijski glikolitički kapacitet izmjeren ECAR-om.
A549 ćelije transficirane sa neciljanom kontrolom (NC) i shSLC7A5 (Sh1, Sh2) su postavljene preko noći u posude prečnika 10 cm.Ćelijski metaboliti su ekstrahovani sa 1 ml ledeno hladnog 80% vodenog metanola.Ćelije u rastvoru metanola su ostrugane, sakupljene u novu epruvetu i centrifugirane na 15.000 × g 15 minuta na 4°C.Sakupite 800 µl supernatanta i osušite pomoću vakuumskog koncentratora velike brzine.Osušene pelete metabolita su zatim analizirane na nivoe triptofana pomoću LC-MS/MS kao što je gore opisano.Nivoi ćelijskog NAD(H) u ćelijama A549 (NC i shSLC7A5) izmereni su pomoću kvantitativnog NAD+/NADH kolorimetrijskog kompleta (#K337, BioVision) prema uputstvima proizvođača.Nivoi proteina su izmjereni za svaki uzorak kako bi se normalizirala količina metabolita.
Za preliminarno određivanje veličine uzorka nisu korištene statističke metode.Prethodne metabolomičke studije usmjerene na otkrivanje biomarkera15,18 smatrane su mjerilima za određivanje veličine, a u poređenju sa ovim izvještajima, naš uzorak je bio adekvatan.Nijedan uzorak nije isključen iz kohorte istraživanja.Uzorci seruma su nasumično raspoređeni u grupu za otkrivanje (306 slučajeva, 74,6%) i grupu za internu validaciju (104 slučaja, 25,4%) za neciljane metabolomičke studije.Također smo nasumično odabrali 70 slučajeva iz svake grupe iz skupa otkrića za ciljane metabolomske studije.Istraživači su bili zaslijepljeni za dodjelu grupa tokom LC-MS prikupljanja i analize podataka.Statističke analize metabolomskih podataka i ćelijskih eksperimenata opisane su u odgovarajućim odjeljcima Rezultati, Legende slika i Metode.Kvantifikacija ćelijskog triptofana, NADT i glikolitičke aktivnosti izvedena je tri puta nezavisno sa identičnim rezultatima.
Za više informacija o dizajnu studije, pogledajte sažetak izvještaja o prirodnom portfoliju povezan s ovim člankom.
Sirovi MS podaci ekstrahiranih karakteristika i normalizirani MS podaci referentnog seruma prikazani su u Dodatnim podacima 1 i Dodatnim podacima 2, respektivno.Napomene o vršnim vrijednostima za diferencijalne karakteristike predstavljene su u Dodatnim podacima 3. LUAD TCGA skup podataka može se preuzeti sa https://portal.gdc.cancer.gov/.Ulazni podaci za crtanje grafikona su dati u izvornim podacima.Izvorni podaci su dati za ovaj članak.
Nacionalna studijska grupa za skrining pluća, itd. Smanjenje smrtnosti od raka pluća uz pomoć kompjuterizovane tomografije malih doza.Sjeverna Engleska.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR i Prophet, PC Skrining karcinoma pluća korištenjem niskih doza spiralnog CT-a: rezultati Nacionalne studije skrininga pluća (NLST).J. Med.Ekran 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Smanjenje smrtnosti od raka pluća volumetrijskim CT skriningom u randomiziranom ispitivanju.Sjeverna Engleska.J. Med.382, 503–513 (2020).
Vrijeme objave: Sep-18-2023