Diferencijalna dijagnoza plućnih nodula identifikovanih kompjuterizovanom tomografijom (CT) i dalje predstavlja izazov u kliničkoj praksi. U ovom radu karakterišemo globalni metabolom 480 uzoraka seruma, uključujući zdrave kontrolne osobe, benigne plućne nodule i adenokarcinom pluća u stadiju I. Adenokarcinomi pokazuju jedinstvene metabolomske profile, dok benigni noduli i zdrave osobe imaju veliku sličnost u metabolomskim profilima. U grupi za otkrivanje (n = 306), identifikovan je skup od 27 metabolita za razlikovanje benignih i malignih nodula. AUC diskriminativnog modela u grupama interne validacije (n = 104) i eksterne validacije (n = 111) bio je 0,915 odnosno 0,945. Analiza puta otkrila je povećane glikolitičke metabolite povezane sa smanjenim triptofanom u serumu adenokarcinoma pluća u poređenju sa benignim nodulima i zdravim kontrolnim osobama, te sugerisala da unos triptofana podstiče glikolizu u ćelijama raka pluća. Naša studija ističe vrijednost biomarkera serumskih metabolita u procjeni rizika od plućnih nodula otkrivenih CT-om.
Rana dijagnoza je ključna za poboljšanje stope preživljavanja pacijenata oboljelih od raka. Rezultati američkog Nacionalnog ispitivanja skrininga raka pluća (NLST) i evropske NELSON studije pokazali su da skrining niskodoznom kompjuteriziranom tomografijom (LDCT) može značajno smanjiti smrtnost od raka pluća u visokorizičnim grupama1,2,3. Od široko rasprostranjene upotrebe LDCT-a za skrining raka pluća, incidencija slučajnih radiografskih nalaza asimptomatskih plućnih čvorića nastavila je rasti4. Plućni čvorići se definiraju kao fokalna zamućenja promjera do 3 cm5. Suočavamo se s poteškoćama u procjeni vjerojatnosti maligniteta i rješavanju velikog broja plućnih čvorića slučajno otkrivenih na LDCT-u. Ograničenja CT-a mogu dovesti do čestih kontrolnih pregleda i lažno pozitivnih rezultata, što dovodi do nepotrebne intervencije i prekomjernog liječenja6. Stoga postoji potreba za razvojem pouzdanih i korisnih biomarkera za pravilnu identifikaciju raka pluća u ranim fazama i diferencijaciju većine benignih čvorića pri početnom otkrivanju7.
Sveobuhvatna molekularna analiza krvi (serum, plazma, mononuklearne ćelije periferne krvi), uključujući genomiku, proteomiku ili metilaciju DNK8,9,10, dovela je do rastućeg interesa za otkriće dijagnostičkih biomarkera za rak pluća. U međuvremenu, metabolomski pristupi mjere ćelijske krajnje produkte na koje utiču endogeni i egzogeni postupci i stoga se primjenjuju za predviđanje početka i ishoda bolesti. Tečna hromatografija-tandem masena spektrometrija (LC-MS) je široko korištena metoda za metabolomske studije zbog svoje visoke osjetljivosti i velikog dinamičkog raspona, koji može pokriti metabolite s različitim fizičko-hemijskim svojstvima11,12,13. Iako je globalna metabolomska analiza plazme/seruma korištena za identifikaciju biomarkera povezanih s dijagnozom raka pluća14,15,16,17 i efikasnošću liječenja,18 klasifikatori serumskih metabolita za razlikovanje benignih i malignih plućnih čvorova tek trebaju biti detaljno proučeni. -masovna istraživanja.
Adenokarcinom i planocelularni karcinom su dva glavna podtipa nemikrocelularnog karcinoma pluća (NSCLC). Različiti CT skrining testovi pokazuju da je adenokarcinom najčešći histološki tip raka pluća1,19,20,21. U ovoj studiji koristili smo ultra-performansnu tečnu hromatografiju-masenu spektrometriju visoke rezolucije (UPLC-HRMS) za metabolomsku analizu na ukupno 695 uzoraka seruma, uključujući zdrave kontrolne osobe, benigne plućne nodule i CT-detektirane ≤3 cm. Skrining za adenokarcinom pluća stadija I. Identificirali smo panel serumskih metabolita koji razlikuju adenokarcinom pluća od benignih nodula i zdravih kontrolnih osoba. Analiza obogaćivanja signalnog puta otkrila je da su abnormalni metabolizam triptofana i glukoze uobičajene promjene kod adenokarcinoma pluća u poređenju sa benignim nodulima i zdravim kontrolnim osobama. Konačno, uspostavili smo i validirali klasifikator serumskog metabolizma sa visokom specifičnošću i osjetljivošću za razlikovanje malignih i benignih plućnih nodula otkrivenih LDCT-om, što može pomoći u ranoj diferencijalnoj dijagnozi i procjeni rizika.
U trenutnoj studiji, retrospektivno su prikupljeni uzorci seruma usklađeni po spolu i dobi od 174 zdrave kontrolne osobe, 292 pacijenta s benignim plućnim čvorićima i 229 pacijenata s adenokarcinomom pluća stadija I. Demografske karakteristike 695 ispitanika prikazane su u Dodatnoj tabeli 1.
Kao što je prikazano na Slici 1a, ukupno 480 uzoraka seruma, uključujući 174 zdrave kontrolne osobe (HC), 170 benignih čvorova (BN) i 136 uzoraka adenokarcinoma pluća (LA) u stadiju I, prikupljeno je u Centru za rak Univerziteta Sun Yat-sen. Kohorta za otkrivanje neciljanog metabolomskog profiliranja korištenjem ultra-performansne tečne hromatografije - masene spektrometrije visoke rezolucije (UPLC-HRMS). Kao što je prikazano na Dodatnoj Slici 1, identificirani su diferencijalni metaboliti između LA i HC, LA i BN kako bi se uspostavio model klasifikacije i dalje istražila analiza diferencijalnih puteva. 104 uzorka koje je prikupio Centar za rak Univerziteta Sun Yat-sen i 111 uzoraka koje su prikupile dvije druge bolnice podvrgnuti su internoj, odnosno eksternoj validaciji.
a Ispitivana populacija u kohorti otkrića koja je podvrgnuta globalnoj analizi metabolomike seruma korištenjem ultra-performansne tekućinske kromatografije - masene spektrometrije visoke rezolucije (UPLC-HRMS). b Diskriminantna analiza parcijalnih najmanjih kvadrata (PLS-DA) ukupnog metaboloma 480 uzoraka seruma iz ispitivane kohorte, uključujući zdrave kontrolne osobe (HC, n = 174), benigne nodule (BN, n = 170) i adenokarcinom pluća stadija I (Los Angeles, n = 136). +ESI, pozitivni mod elektrosprej ionizacije, -ESI, negativni mod elektrosprej ionizacije. c–e Metaboliti sa značajno različitom abundancijom u dvije date grupe (dvostrani Wilcoxon test predznačenih rangova, p-vrijednost prilagođena stopi lažnog otkrića, FDR <0,05) prikazani su crvenom (promjena puta > 1,2) i plavom bojom (promjena puta < 0,83). ) prikazano na grafici vulkana. f Hijerarhijska toplotna mapa klasteriranja koja prikazuje značajne razlike u broju označenih metabolita između LA i BN. Izvorni podaci se daju u obliku izvornih datoteka.
Ukupni serumski metabolom 174 HC, 170 BN i 136 LA u grupi otkrića analiziran je korištenjem UPLC-HRMS analize. Prvo pokazujemo da se uzorci kontrole kvalitete (QC) čvrsto grupiraju u središtu modela nenadzirane analize glavnih komponenti (PCA), što potvrđuje stabilnost učinka trenutne studije (Dodatna slika 2).
Kao što je prikazano u analizi parcijalnih najmanjih kvadrata-diskriminacije (PLS-DA) na Slici 1b, otkrili smo da postoje jasne razlike između LA i BN, LA i HC u pozitivnom (+ESI) i negativnom (−ESI) modu elektrosprej jonizacije. Međutim, nisu pronađene značajne razlike između BN i HC u +ESI i -ESI uslovima.
Pronašli smo 382 diferencijalne karakteristike između LA i HC, 231 diferencijalnu karakteristiku između LA i BN, i 95 diferencijalnih karakteristika između BN i HC (Wilcoxon test označenih rangova, FDR <0,05 i višestruke promjene >1,2 ili <0,83) (Slika .1c-e). Vrhovi su dalje označeni (Dodatni podaci 3) u odnosu na bazu podataka (mzCloud/HMDB/Chemspider biblioteka) pomoću m/z vrijednosti, vremena zadržavanja i pretraživanja masenog spektra fragmentacije (detalji opisani u odjeljku Metode) 22. Konačno, identificirano je 33 i 38 označenih metabolita sa značajnim razlikama u zastupljenosti za LA u odnosu na BN (Slika 1f i Dodatna tabela 2) i LA u odnosu na HC (Dodatna slika 3 i Dodatna tabela 2). Nasuprot tome, u BN i HC identificirana su samo 3 metabolita sa značajnim razlikama u zastupljenosti (Dodatna tabela 2), što je u skladu s preklapanjem između BN i HC u PLS-DA. Ovi diferencijalni metaboliti pokrivaju širok raspon biohemijskih supstanci (Dodatna slika 4). Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju značajne promjene u serumskom metabolomu koje odražavaju malignu transformaciju raka pluća u ranom stadiju u poređenju sa benignim plućnim čvorićima ili zdravim osobama. U međuvremenu, sličnost serumskog metaboloma BN i HC sugerira da benigni plućni čvorići mogu dijeliti mnoge biološke karakteristike sa zdravim osobama. S obzirom na to da su mutacije gena receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) česte kod adenokarcinoma pluća podtipa 23, nastojali smo utvrditi utjecaj mutacija pokretača na serumski metabolom. Zatim smo analizirali ukupni metabolomski profil 72 slučaja sa EGFR statusom u grupi adenokarcinoma pluća. Zanimljivo je da smo pronašli uporedive profile između pacijenata sa EGFR mutantima (n = 41) i pacijenata sa EGFR divljim tipom (n = 31) u PCA analizi (Dodatna slika 5a). Međutim, identificirali smo 7 metabolita čija je zastupljenost značajno promijenjena kod pacijenata s mutacijom EGFR-a u usporedbi s pacijentima s divljim tipom EGFR-a (t-test, p < 0,05 i promjena struka > 1,2 ili < 0,83) (Dodatna slika 5b). Većina ovih metabolita (5 od 7) su acilkarnitini, koji igraju važnu ulogu u putevima oksidacije masnih kiselina.
Kao što je ilustrovano u toku rada prikazanom na Slici 2a, biomarkeri za klasifikaciju nodula dobijeni su korištenjem operatora najmanjeg apsolutnog smanjenja i selekcije zasnovane na 33 diferencijalna metabolita identifikovana u LA (n = 136) i BN (n = 170). Najbolja kombinacija varijabli (LASSO) – binarni logistički regresijski model. Za testiranje pouzdanosti modela korištena je desetostruka unakrsna validacija. Selekcija varijabli i regularizacija parametara prilagođeni su kaznom za maksimizaciju vjerovatnoće sa parametrom λ24. Globalna metabolomska analiza je dalje izvršena nezavisno u grupama interne validacije (n = 104) i eksterne validacije (n = 111) kako bi se testirala efikasnost klasifikacije diskriminantnog modela. Kao rezultat toga, 27 metabolita u skupu za otkrivanje identifikovano je kao najbolji diskriminantni model sa najvećom srednjom AUC vrijednošću (Slika 2b), među kojima je 9 imalo povećanu aktivnost, a 18 smanjenu aktivnost u LA u poređenju sa BN (Slika 2c).
Tok rada za izgradnju klasifikatora plućnih nodula, uključujući odabir najboljeg panela serumskih metabolita u skupu za otkrivanje korištenjem binarnog logističkog regresijskog modela putem desetostruke unakrsne validacije i procjenu prediktivnih performansi u skupovima za internu i eksternu validaciju. b Statistika unakrsne validacije LASSO regresijskog modela za odabir metaboličkih biomarkera. Brojevi dati gore predstavljaju prosječan broj biomarkera odabranih pri datom λ. Crvena isprekidana linija predstavlja prosječnu vrijednost AUC-a pri odgovarajućoj lambda. Sive trake greške predstavljaju minimalne i maksimalne vrijednosti AUC-a. Isprekidana linija označava najbolji model sa 27 odabranih biomarkera. AUC, površina ispod krive ROC (Receiver Operating Characteristic). c Promjene u pregibima 27 odabranih metabolita u LA grupi u poređenju sa BN grupom u grupi za otkrivanje. Crveni stupac – aktivacija. Plavi stupac predstavlja pad. d–f Krive ROC (Receiver Operating Characteristic) koje prikazuju snagu diskriminativnog modela na osnovu 27 kombinacija metabolita u skupovima za otkrivanje, internu i eksternu validaciju. Izvorni podaci su dati u obliku izvornih datoteka podataka.
Model predviđanja kreiran je na osnovu ponderiranih regresijskih koeficijenata ovih 27 metabolita (Dodatna tabela 3). ROC analiza zasnovana na ovih 27 metabolita dala je vrijednost površine ispod krive (AUC) od 0,933, osjetljivost grupe za otkrivanje bila je 0,868, a specifičnost 0,859 (Slika 2d). U međuvremenu, među 38 označenih diferencijalnih metabolita između LA i HC, skup od 16 metabolita postigao je AUC od 0,902 sa osjetljivošću od 0,801 i specifičnošću od 0,856 u razlikovanju LA od HC (Dodatna slika 6a-c). Također su upoređene vrijednosti AUC zasnovane na različitim pragovima promjene fold-a za diferencijalne metabolite. Otkrili smo da je model klasifikacije pokazao najbolje rezultate u razlikovanju između LA i BN (HC) kada je nivo promjene fold-a postavljen na 1,2 u odnosu na 1,5 ili 2,0 (Dodatna slika 7a,b). Model klasifikacije, zasnovan na 27 grupa metabolita, dalje je validiran u internim i eksternim kohortama. AUC je bio 0,915 (osjetljivost 0,867, specifičnost 0,811) za internu validaciju i 0,945 (osjetljivost 0,810, specifičnost 0,979) za eksternu validaciju (slika 2e, f). Da bi se procijenila međulaboratorijska efikasnost, 40 uzoraka iz eksterne kohorte analizirano je u eksternoj laboratoriji kao što je opisano u odjeljku Metode. Tačnost klasifikacije dostigla je AUC od 0,925 (Dodatna slika 8). Budući da je planocelularni karcinom pluća (LUSC) drugi najčešći podtip nemikrocelularnog karcinoma pluća (NSCLC) nakon adenokarcinoma pluća (LUAD), testirali smo i validiranu potencijalnu korisnost metaboličkih profila. BN i 16 slučajeva LUSC. AUC diskriminacije između LUSC i BN bio je 0,776 (Dodatna slika 9), što ukazuje na slabiju sposobnost u poređenju sa razlikovanjem između LUAD i BN.
Studije su pokazale da veličina nodula na CT snimcima pozitivno korelira s vjerojatnošću maligniteta i ostaje glavni faktor koji određuje liječenje nodula25,26,27. Analiza podataka iz velike kohorte NELSON studije skrininga pokazala je da je rizik od maligniteta kod ispitanika s čvorovima <5 mm bio čak sličan onome kod ispitanika bez čvorova28. Stoga je minimalna veličina koja zahtijeva redovan CT nadzor 5 mm, kako preporučuje Britansko torakalno društvo (BTS), i 6 mm, kako preporučuje Fleischnerovo društvo29. Međutim, noduli veći od 6 mm i bez očiglednih benignih karakteristika, nazvani neodređeni plućni noduli (IPN), ostaju glavni izazov u evaluaciji i liječenju u kliničkoj praksi30,31. Zatim smo ispitali utječe li veličina nodula na metabolomske potpise koristeći združene uzorke iz kohorti za otkrivanje i internu validaciju. Fokusirajući se na 27 validiranih biomarkera, prvo smo usporedili PCA profile metaboloma HC i BN ispod 6 mm. Otkrili smo da se većina podataka za HC i BN preklapa, što pokazuje da su nivoi metabolita u serumu bili slični u obje grupe (slika 3a). Mape karakteristika u različitim rasponima veličina ostale su očuvane u BN i LA (slika 3b, c), dok je uočeno razdvajanje između malignih i benignih čvorova u rasponu od 6 do 20 mm (slika 3d). Ova kohorta imala je AUC od 0,927, specifičnost od 0,868 i osjetljivost od 0,820 za predviđanje maligniteta čvorova veličine od 6 do 20 mm (slika 3e, f). Naši rezultati pokazuju da klasifikator može uhvatiti metaboličke promjene uzrokovane ranom malignom transformacijom, bez obzira na veličinu čvora.
ad Poređenje PCA profila između specificiranih grupa na osnovu metaboličkog klasifikatora od 27 metabolita. CC i BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. u LA 6–20 mm vs LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm i LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e ROC kriva (Receiver Operating Characteristic) koja prikazuje performanse diskriminativnog modela za nodule 6–20 mm. f Vrijednosti vjerovatnoće su izračunate na osnovu logističkog regresijskog modela za nodule veličine 6–20 mm. Siva isprekidana linija predstavlja optimalnu graničnu vrijednost (0,455). Gornji brojevi predstavljaju procenat slučajeva predviđenih za Los Angeles. Koristite dvostrani Studentov t-test. PCA, analiza glavnih komponenti. AUC površina ispod krive. Izvorni podaci su dati u obliku izvornih datoteka.
Četiri uzorka (starosti 44–61 godine) sa sličnim veličinama plućnih čvorova (7–9 mm) dodatno su odabrana kako bi se ilustrirale performanse predloženog modela predviđanja maligniteta (Slika 4a, b). Pri početnom skriningu, Slučaj 1 se predstavio kao čvrsti čvor sa kalcifikacijom, karakteristikom povezanom sa benignošću, dok se Slučaj 2 predstavio kao neodređeni djelimično čvrsti čvor bez očiglednih benignih karakteristika. Tri runde kontrolnih CT skeniranja pokazala su da su ovi slučajevi ostali stabilni tokom perioda od 4 godine i stoga su smatrani benignim čvorovima (Slika 4a). U poređenju sa kliničkom evaluacijom serijskih CT skeniranja, analiza metabolita u jednom snimku seruma sa trenutnim modelom klasifikatora brzo je i tačno identifikovala ove benigne čvorove na osnovu vjerovatnosnih ograničenja (Tabela 1). Slika 4b u slučaju 3 prikazuje čvor sa znacima pleuralne retrakcije, koja je najčešće povezana sa malignitetom32. Slučaj 4 se predstavio kao neodređeni djelimično čvrsti čvor bez dokaza o benignom uzroku. Svi ovi slučajevi su predviđeni kao maligni prema modelu klasifikatora (Tabela 1). Procjena adenokarcinoma pluća dokazana je histopatološkim pregledom nakon operacije resekcije pluća (slika 4b). Za eksterni validacijski set, metabolički klasifikator je precizno predvidio dva slučaja neodređenih plućnih nodula većih od 6 mm (dodatna slika 10).
CT snimci aksijalnog prozora pluća dva slučaja benignih čvorova. U slučaju 1, CT snimka nakon 4 godine pokazala je stabilan čvrsti čvor promjera 7 mm s kalcifikacijom u donjem desnom režnju. U slučaju 2, CT snimka nakon 5 godina otkrila je stabilan, djelomično čvrsti čvor promjera 7 mm u gornjem desnom režnju. b Aksijalni CT snimci pluća i odgovarajuće patološke studije dva slučaja adenokarcinoma stadija I prije resekcije pluća. Slučaj 3 otkrio je čvor promjera 8 mm u gornjem desnom režnju s pleuralnom retrakcijom. Slučaj 4 otkrio je djelomično čvrsti čvorić u obliku matiranog stakla promjera 9 mm u gornjem lijevom režnju. Bojenje reseciranog plućnog tkiva hematoksilinom i eozinom (H&E) (skala = 50 μm) demonstrira acinarni obrazac rasta adenokarcinoma pluća. Strelice označavaju čvoriće otkrivene na CT snimcima. H&E snimci su reprezentativne slike višestrukih (>3) mikroskopskih polja koje je pregledao patolog.
Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju potencijalnu vrijednost biomarkera serumskih metabolita u diferencijalnoj dijagnozi plućnih nodula, što može predstavljati izazov prilikom procjene CT skrininga.
Na osnovu validiranog diferencijalnog panela metabolita, nastojali smo identificirati biološke korelate glavnih metaboličkih promjena. Analiza obogaćivanja KEGG puta koju je proveo MetaboAnalyst identificirala je 6 zajedničkih značajno izmijenjenih puteva između dvije date grupe (LA vs. HC i LA vs. BN, prilagođeno p ≤ 0,001, efekat > 0,01). Ove promjene su karakterizirane poremećajima u metabolizmu piruvata, metabolizmu triptofana, metabolizmu niacina i nikotinamida, glikolizi, TCA ciklusu i metabolizmu purina (Slika 5a). Zatim smo dalje proveli ciljanu metabolomiku kako bismo provjerili glavne promjene korištenjem apsolutne kvantifikacije. Određivanje uobičajenih metabolita u uobičajeno izmijenjenim putevima pomoću trostruke kvadrupolne masene spektrometrije (QQQ) korištenjem autentičnih standarda metabolita. Demografske karakteristike ciljnog uzorka metabolomske studije uključene su u Dodatnu tabelu 4. U skladu s našim globalnim rezultatima metabolomike, kvantitativna analiza potvrdila je da su hipoksantin i ksantin, piruvat i laktat bili povećani u LA u poređenju sa BN i HC (Slika 5b, c, p <0,05). Međutim, nisu pronađene značajne razlike u ovim metabolitima između BN i HC.
Analiza obogaćivanja KEGG puta značajno različitih metabolita u LA grupi u poređenju sa BN i HC grupama. Korišten je dvostrani Globaltest, a p vrijednosti su prilagođene Holm-Bonferronijevom metodom (prilagođeno p ≤ 0,001 i veličina efekta > 0,01). b–d Violin dijagrami prikazuju nivoe hipoksantina, ksantina, laktata, piruvata i triptofana u serumu HC, BN i LA određene LC-MS/MS (n = 70 po grupi). Bijele i crne isprekidane linije označavaju medijan i kvartil, respektivno. e Violin dijagram prikazuje normalizovanu Log2TPM (transkripti na milion) mRNA ekspresiju SLC7A5 i QPRT u adenokarcinomu pluća (n = 513) u poređenju sa normalnim tkivom pluća (n = 59) u LUAD-TCGA skupu podataka. Bijeli okvir predstavlja interkvartilni raspon, horizontalna crna linija u centru predstavlja medijanu, a vertikalna crna linija koja se proteže od okvira predstavlja 95% interval pouzdanosti (CI). f Pearsonov korelacijski dijagram ekspresije SLC7A5 i GAPDH u adenokarcinomu pluća (n = 513) i normalnom tkivu pluća (n = 59) u TCGA skupu podataka. Sivo područje predstavlja 95% CI. r, Pearsonov koeficijent korelacije. g Normalizirani ćelijski nivoi triptofana u A549 ćelijama transfektiranim nespecifičnom shRNA kontrolom (NC) i shSLC7A5 (Sh1, Sh2) određenim LC-MS/MS. Prikazana je statistička analiza pet biološki nezavisnih uzoraka u svakoj grupi. h Ćelijski nivoi NADt (ukupni NAD, uključujući NAD+ i NADH) u A549 ćelijama (NC) i SLC7A5 knockdown A549 ćelijama (Sh1, Sh2). Prikazana je statistička analiza tri biološki nezavisna uzorka u svakoj grupi. i Glikolitička aktivnost A549 ćelija prije i nakon eliminacije SLC7A5 mjerena je brzinom ekstracelularnog zakiseljavanja (ECAR) (n = 4 biološki nezavisna uzorka po grupi). 2-DG,2-deoksi-D-glukoza. Dvostrani Studentov t-test korišten je u (b–h). U (g–i), stupci greške predstavljaju srednju vrijednost ± SD, svaki eksperiment je izveden tri puta nezavisno i rezultati su bili slični. Izvorni podaci su dati u obliku izvornih datoteka.
Uzimajući u obzir značajan utjecaj promijenjenog metabolizma triptofana u LA grupi, također smo procijenili nivoe triptofana u serumu u HC, BN i LA grupama koristeći QQQ. Otkrili smo da je serumski triptofan smanjen u LA u poređenju sa HC ili BN (p < 0,001, Slika 5d), što je u skladu s prethodnim nalazima da su nivoi triptofana u cirkulaciji niži kod pacijenata s rakom pluća nego kod zdravih kontrola iz kontrolne grupe33,34,35. Druga studija koja je koristila PET/CT traser 11C-metil-L-triptofan otkrila je da je vrijeme zadržavanja signala triptofana u tkivu raka pluća značajno povećano u poređenju s benignim lezijama ili normalnim tkivom36. Pretpostavljamo da smanjenje triptofana u serumu LA može odražavati aktivno preuzimanje triptofana od strane ćelija raka pluća.
Također je poznato da je krajnji produkt kinureninskog puta katabolizma triptofana NAD+37,38, koji je važan supstrat za reakciju gliceraldehid-3-fosfata sa 1,3-bisfosfogliceratom u glikolizi39. Dok su se prethodne studije fokusirale na ulogu katabolizma triptofana u imunološkoj regulaciji, mi smo nastojali razjasniti međudjelovanje između disregulacije triptofana i glikolitičkih puteva uočenih u trenutnoj studiji. Poznato je da je član 5 porodice transportera rastvorenih supstanci 7 (SLC7A5) transporter triptofana43,44,45. Kinolinska kiselina fosforiboziltransferaza (QPRT) je enzim koji se nalazi nizvodno od kinureninskog puta koji pretvara kinolinsku kiselinu u NAMN46. Pregledom LUAD TCGA skupa podataka otkriveno je da su i SLC7A5 i QPRT značajno pojačano regulirani u tumorskom tkivu u poređenju sa normalnim tkivom (slika 5e). Ovo povećanje je uočeno u stadijima I i II, kao i u stadijima III i IV adenokarcinoma pluća (Dodatna slika 11), što ukazuje na rane poremećaje u metabolizmu triptofana povezane s tumorogenezom.
Pored toga, LUAD-TCGA skup podataka pokazao je pozitivnu korelaciju između ekspresije SLC7A5 i GAPDH mRNA u uzorcima pacijenata oboljelih od raka (r = 0,45, p = 1,55E-26, Slika 5f). Nasuprot tome, nije pronađena značajna korelacija između takvih genskih potpisa u normalnom tkivu pluća (r = 0,25, p = 0,06, Slika 5f). Utišavanje SLC7A5 (Dopunska slika 12) u A549 ćelijama značajno je smanjilo ćelijske nivoe triptofana i NAD(H) (Slika 5g,h), što je rezultiralo smanjenom glikolitičkom aktivnošću mjerenom brzinom ekstracelularnog zakiseljavanja (ECAR) (Slika 1). 5i). Dakle, na osnovu metaboličkih promjena u serumu i in vitro detekcije, pretpostavljamo da metabolizam triptofana može proizvesti NAD+ putem kinureninskog puta i igrati važnu ulogu u promovisanju glikolize kod raka pluća.
Studije su pokazale da veliki broj neodređenih plućnih nodula otkrivenih LDCT-om može dovesti do potrebe za dodatnim testiranjem kao što su PET-CT, biopsija pluća i prekomjerno liječenje zbog lažno pozitivne dijagnoze maligniteta.31 Kao što je prikazano na Slici 6, naša studija je identificirala panel serumskih metabolita s potencijalnom dijagnostičkom vrijednošću koji mogu poboljšati stratifikaciju rizika i naknadno liječenje plućnih nodula otkrivenih CT-om.
Plućni noduli se procjenjuju korištenjem kompjuterizirane tomografije niskih doza (LDCT) sa slikovnim karakteristikama koje ukazuju na benigne ili maligne uzroke. Neizvjestan ishod nodula može dovesti do čestih kontrolnih pregleda, nepotrebnih intervencija i prekomjernog liječenja. Uključivanje serumskih metaboličkih klasifikatora s dijagnostičkom vrijednošću može poboljšati procjenu rizika i naknadno liječenje plućnih nodula. PET pozitronska emisiona tomografija.
Podaci iz američke NLST studije i evropske NELSON studije ukazuju na to da skrining visokorizičnih grupa niskodoznom kompjuterizovanom tomografijom (LDCT) može smanjiti smrtnost od raka pluća1,3. Međutim, procjena rizika i naknadno kliničko liječenje velikog broja slučajno otkrivenih plućnih čvorova LDCT-om ostaju najveći izazov. Glavni cilj je optimizacija ispravne klasifikacije postojećih protokola zasnovanih na LDCT-u uključivanjem pouzdanih biomarkera.
Određeni molekularni biomarkeri, poput metabolita u krvi, identificirani su poređenjem raka pluća sa zdravim kontrolnim subjektima15,17. U trenutnoj studiji fokusirali smo se na primjenu analize metabolomike seruma kako bismo razlikovali benigne i maligne plućne čvoriće slučajno otkrivene LDCT-om. Uporedili smo globalni metabolom seruma uzoraka zdrave kontrolne grupe (HC), benignih plućnih čvorića (BN) i uzoraka adenokarcinoma pluća (LA) stadija I koristeći UPLC-HRMS analizu. Otkrili smo da HC i BN imaju slične metaboličke profile, dok je LA pokazao značajne promjene u poređenju sa HC i BN. Identificirali smo dva seta metabolita u serumu koji razlikuju LA od HC i BN.
Trenutna shema identifikacije benignih i malignih čvorova zasnovana na LDCT-u uglavnom se zasniva na veličini, gustoći, morfologiji i brzini rasta čvorova tokom vremena30. Prethodne studije su pokazale da je veličina čvorova usko povezana s vjerojatnošću raka pluća. Čak i kod pacijenata s visokim rizikom, rizik od maligniteta u čvorovima <6 mm je <1%. Rizik od maligniteta za čvorove veličine 6 do 20 mm kreće se od 8% do 64%30. Stoga, Fleischnerovo društvo preporučuje granični promjer od 6 mm za rutinsko CT praćenje.29 Međutim, procjena rizika i liječenje neodređenih plućnih čvorova (IPN) većih od 6 mm nisu adekvatno provedeni31. Trenutno liječenje kongenitalnih srčanih mana obično se zasniva na budnom čekanju s čestim CT praćenjem.
Na osnovu validiranog metaboloma, prvi put smo pokazali preklapanje metabolomskih potpisa između zdravih osoba i benignih nodula <6 mm. Biološka sličnost je u skladu s prethodnim CT nalazima da je rizik od maligniteta za nodule <6 mm nizak kao i kod ispitanika bez nodula.30 Treba napomenuti da naši rezultati također pokazuju da benigni noduli <6 mm i ≥6 mm imaju veliku sličnost u metabolomskim profilima, što sugerira da je funkcionalna definicija benigne etiologije konzistentna bez obzira na veličinu nodula. Stoga, moderni dijagnostički paneli serumskih metabolita mogu pružiti jedinstveni test kao test isključivanja kada se noduli početno otkriju na CT-u i potencijalno smanjiti serijsko praćenje. Istovremeno, isti panel metaboličkih biomarkera razlikovao je maligne nodule veličine ≥6 mm od benignih nodula i pružio tačna predviđanja za IPN-ove slične veličine i dvosmislenih morfoloških karakteristika na CT slikama. Ovaj klasifikator serumskog metabolizma dobro se pokazao u predviđanju maligniteta nodula ≥6 mm s AUC od 0,927. Uzeti zajedno, naši rezultati ukazuju na to da jedinstveni serumski metabolomski potpisi mogu specifično odražavati rane metaboličke promjene izazvane tumorom i imati potencijalnu vrijednost kao prediktori rizika, neovisno o veličini čvora.
Značajno je da su adenokarcinom pluća (LUAD) i karcinom skvamoznih ćelija (LUSC) glavni tipovi nemikrocelularnog karcinoma pluća (NSCLC). S obzirom na to da je LUSC snažno povezan s upotrebom duhana47 i da je LUAD najčešća histologija slučajno otkrivenih plućnih čvorova CT skriningom48, naš klasifikatorski model je posebno izgrađen za uzorke adenokarcinoma stadija I. Wang i kolege su se također fokusirali na LUAD i identificirali devet lipidnih potpisa koristeći lipidomiku kako bi razlikovali rak pluća u ranom stadiju od zdravih osoba17. Testirali smo trenutni klasifikatorski model na 16 slučajeva LUSC-a stadija I i 74 benigna čvora i uočili nisku tačnost predviđanja LUSC-a (AUC 0,776), što sugerira da LUAD i LUSC mogu imati vlastite metabolomske potpise. Zaista, pokazalo se da se LUAD i LUSC razlikuju po etiologiji, biološkom porijeklu i genetskim aberacijama49. Stoga bi druge vrste histologije trebale biti uključene u modele obuke za otkrivanje raka pluća na nivou populacije u programima skrininga.
Ovdje smo identificirali šest najčešće promijenjenih metaboličkih puteva kod adenokarcinoma pluća u poređenju sa zdravim kontrolnim grupama i benignim nodulima. Ksantin i hipoksantin su uobičajeni metaboliti metaboličkog puta purina. U skladu s našim rezultatima, međuprodukti povezani s metabolizmom purina bili su značajno povećani u serumu ili tkivima pacijenata s adenokarcinomom pluća u poređenju sa zdravim kontrolnim grupama ili pacijentima u preinvazivnoj fazi15,50. Povišeni nivoi ksantina i hipoksantina u serumu mogu odražavati anabolizam potreban za brzo proliferirajuće ćelije raka. Disregulacija metabolizma glukoze je dobro poznati obilježje metabolizma raka51. Ovdje smo uočili značajan porast piruvata i laktata u LA grupi u poređenju sa HC i BN grupom, što je u skladu s prethodnim izvještajima o abnormalnostima glikolitičkog puta u profilima metaboloma u serumu pacijenata s nemikrocelularnim karcinomom pluća (NSCLC) i zdravih kontrolnih grupa. Rezultati su konzistentni52,53.
Važno je napomenuti da smo uočili inverznu korelaciju između metabolizma piruvata i triptofana u serumu adenokarcinoma pluća. Serumski nivoi triptofana bili su smanjeni u LA grupi u poređenju sa HC ili BN grupom. Zanimljivo je da je prethodna velika studija koja je koristila prospektivnu kohortu otkrila da su niski nivoi triptofana u cirkulaciji povezani sa povećanim rizikom od raka pluća 54. Triptofan je esencijalna aminokiselina koju u potpunosti dobijamo iz hrane. Zaključujemo da smanjenje serumskog triptofana kod adenokarcinoma pluća može odražavati brzo smanjenje ovog metabolita. Dobro je poznato da je krajnji produkt katabolizma triptofana putem kinureninskog puta izvor de novo sinteze NAD+. Budući da se NAD+ prvenstveno proizvodi putem puta spašavanja, važnost NAD+ u metabolizmu triptofana u zdravlju i bolesti tek treba da se utvrdi46. Naša analiza TCGA baze podataka pokazala je da je ekspresija transportera triptofana, transportera rastvorenih supstanci 7A5 (SLC7A5), značajno povećana kod adenokarcinoma pluća u poređenju sa normalnim kontrolama i da je pozitivno korelirala sa ekspresijom glikolitičkog enzima GAPDH. Prethodne studije su se uglavnom fokusirale na ulogu katabolizma triptofana u suzbijanju antitumorskog imunološkog odgovora40,41,42. Ovdje pokazujemo da inhibicija unosa triptofana smanjenjem SLC7A5 u ćelijama raka pluća rezultira naknadnim smanjenjem nivoa NAD u ćelijama i istovremenim slabljenjem glikolitičke aktivnosti. Ukratko, naša studija pruža biološku osnovu za promjene u metabolizmu seruma povezane sa malignom transformacijom adenokarcinoma pluća.
EGFR mutacije su najčešće pokretačke mutacije kod pacijenata sa NSCLC-om. U našoj studiji smo otkrili da pacijenti sa EGFR mutacijom (n = 41) imaju ukupne metabolomske profile slične pacijentima sa divljim tipom EGFR-a (n = 31), iako smo pronašli smanjene serumske nivoe nekih pacijenata sa EGFR mutantima kod pacijenata sa acilkarnitinom. Utvrđena funkcija acilkarnitina je transport acil grupa iz citoplazme u mitohondrijski matriks, što dovodi do oksidacije masnih kiselina radi proizvodnje energije 55. U skladu sa našim nalazima, nedavna studija je također identifikovala slične profile metaboloma između EGFR mutantnih i EGFR divljeg tipa tumora analizirajući globalni metabolom 102 uzorka tkiva adenokarcinoma pluća 50. Zanimljivo je da je sadržaj acilkarnitina pronađen i u grupi sa EGFR mutantima. Stoga, da li promjene u nivoima acilkarnitina odražavaju EGFR-inducirane metaboličke promjene i osnovne molekularne puteve, može zahtijevati daljnja istraživanja.
Zaključno, naša studija uspostavlja klasifikator serumskog metabolizma za diferencijalnu dijagnozu plućnih nodula i predlaže tijek rada koji može optimizirati procjenu rizika i olakšati kliničko liječenje na osnovu CT skeniranja.
Ovu studiju odobrio je Etički komitet Onkološke bolnice Univerziteta Sun Yat-sen, Prve pridružene bolnice Univerziteta Sun Yat-sen i Etički komitet Onkološke bolnice Univerziteta Zhengzhou. U grupama za otkrivanje i internu validaciju, prikupljeno je 174 seruma od zdravih osoba i 244 seruma iz benignih čvorova od osoba koje su se podvrgavale godišnjim medicinskim pregledima na Odjelu za kontrolu i prevenciju raka, Onkološkog centra Univerziteta Sun Yat-sen, te 166 benignih čvorova. Adenokarcinomi pluća stadija I prikupljeni su iz Onkološkog centra Univerziteta Sun Yat-sen. U kohorti za eksternu validaciju bilo je 48 slučajeva benignih čvorova, 39 slučajeva adenokarcinoma pluća stadija I iz Prve pridružene bolnice Univerziteta Sun Yat-sen i 24 slučaja adenokarcinoma pluća stadija I iz Onkološke bolnice Zhengzhou. Onkološki centar Univerziteta Sun Yat-sen također je prikupio 16 slučajeva planocelularnog karcinoma pluća stadija I kako bi testirao dijagnostičku sposobnost utvrđenog metaboličkog klasifikatora (karakteristike pacijenata prikazane su u Dodatnoj tabeli 5). Uzorci iz kohorte za otkrivanje i kohorte za internu validaciju prikupljeni su između januara 2018. i maja 2020. Uzorci za kohortu za eksternu validaciju prikupljeni su između augusta 2021. i oktobra 2022. Kako bi se smanjila rodna pristrasnost, svakoj kohorti je dodijeljen približno jednak broj muških i ženskih slučajeva. Tim za otkrivanje i Tim za internu reviziju. Spol učesnika određen je na osnovu samoprocjene. Svi učesnici su dali informirani pristanak i nije im data nikakva naknada. Ispitanici sa benignim čvorićima bili su oni sa stabilnim rezultatom CT skeniranja u periodu od 2 do 5 godina u vrijeme analize, osim 1 slučaja iz uzorka za eksternu validaciju, koji je prikupljen preoperativno i dijagnosticiran histopatologijom. Izuzetak je hronični bronhitis. Slučajevi adenokarcinoma pluća prikupljeni su prije resekcije pluća i potvrđeni patološkom dijagnozom. Uzorci krvi natašte prikupljeni su u epruvete za separaciju seruma bez ikakvih antikoagulansa. Uzorci krvi su zgrušavani 1 sat na sobnoj temperaturi, a zatim centrifugirani na 2851 × g tokom 10 minuta na 4°C kako bi se sakupio serumski supernatant. Alikvoti seruma su zamrznuti na -80°C do ekstrakcije metabolita. Odjel za prevenciju raka i medicinska ispitivanja Centra za rak Univerziteta Sun Yat-sen prikupio je uzorke seruma od 100 zdravih donora, uključujući jednak broj muškaraca i žena starosti od 40 do 55 godina. Jednake količine uzorka svakog donora su pomiješane, rezultirajući uzorci su alikvotirani i pohranjeni na -80°C. Smjesa seruma je korištena kao referentni materijal za kontrolu kvalitete i standardizaciju podataka.
Referentni serum i testni uzorci su odmrznuti, a metaboliti su ekstrahirani korištenjem kombinovane metode ekstrakcije (MTBE/metanol/voda) 56. Ukratko, 50 μl seruma je pomiješano sa 225 μl ledeno hladnog metanola i 750 μl ledeno hladnog metil tert-butil etera (MTBE). Smjesu je promiješano i inkubirano na ledu 1 sat. Uzorci su zatim pomiješani i vrtloženi sa 188 μl vode MS kvalitete koja sadrži interne standarde (13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metionin i 13C6-izoleucin, kupljeni od Cambridge Isotope Laboratories). Smjesa je zatim centrifugirana na 15.000 × g tokom 10 minuta na 4 °C, a donja faza je prebačena u dvije epruvete (po 125 μL) za LC-MS analizu u pozitivnom i negativnom modu. Konačno, uzorak je isparavan do suhog u vakuumskom koncentratoru velike brzine.
Osušeni metaboliti su rekonstituisani u 120 μl 80% acetonitrila, vrtloženi 5 minuta i centrifugirani na 15.000 × g tokom 10 minuta na 4°C. Supernatanti su prebačeni u jantarne staklene bočice s mikroumetcima za metabolomske studije. Neciljana metabolomska analiza na platformi ultra-performansne tekućinske kromatografije - masene spektrometrije visoke rezolucije (UPLC-HRMS). Metaboliti su odvojeni korištenjem Dionex Ultimate 3000 UPLC sistema i ACQUITY BEH Amide kolone (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). U modu pozitivnih iona, mobilne faze su bile 95% (A) i 50% acetonitrila (B), a svaka je sadržavala 10 mmol/L amonijum acetata i 0,1% mravlje kiseline. U negativnom modu, mobilne faze A i B sadržavale su 95% odnosno 50% acetonitrila, obje faze su sadržavale 10 mmol/L amonijum acetata, pH = 9. Gradijentni program je bio sljedeći: 0–0,5 min, 2% B; 0,5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16,1 min, 98–2% B; 16,1–20 min, 2% B. Kolona je održavana na 40°C, a uzorak na 10°C u autosampleru. Brzina protoka bila je 0,3 ml/min, a volumen ubrizgavanja bio je 3 μl. Q-Exactive Orbitrap maseni spektrometar (Thermo Fisher Scientific) sa izvorom elektrosprej ionizacije (ESI) radio je u modu punog skeniranja i povezan s ddMS2 modom praćenja kako bi se prikupile velike količine podataka. MS parametri su postavljeni na sljedeći način: napon spreja +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatura kapilare 320°C, zaštitni plin 40 arb, pomoćni plin 10 arb, temperatura grijača sonde 350°C, raspon skeniranja 70–1050 m/h, rezolucija 70 000. Podaci su prikupljeni korištenjem Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Za procjenu kvaliteta podataka, generirani su združeni uzorci kontrole kvalitete (QC) uklanjanjem alikvota od 10 μL supernatanta iz svakog uzorka. Šest injekcija uzoraka kontrole kvalitete analizirano je na početku analitičke sekvence kako bi se procijenila stabilnost UPLC-MS sistema. Uzorci kontrole kvalitete zatim se periodično unose u seriju. Svih 11 serija uzoraka seruma u ovoj studiji analizirano je LC-MS-om. Alikvoti smjese seruma od 100 zdravih donora korišteni su kao referentni materijal u odgovarajućim serijama za praćenje procesa ekstrakcije i prilagođavanje efektima od serije do serije. Neciljana metabolomska analiza kohorte za otkrivanje, interne validacijske kohorte i eksterne validacijske kohorte provedena je u Centru za metabolomiku Univerziteta Sun Yat-sen. Vanjska laboratorija Centra za analizu i testiranje Tehnološkog univerziteta Guangdong također je analizirala 40 uzoraka iz eksterne kohorte kako bi testirala performanse modela klasifikatora.
Nakon ekstrakcije i rekonstitucije, apsolutna kvantifikacija serumskih metabolita izmjerena je korištenjem ultra-visokoefikasne tekućinske kromatografije-tandem masene spektrometrije (Agilent 6495 trostruki kvadrupol) s izvorom elektrosprej ionizacije (ESI) u modu višestrukog praćenja reakcija (MRM). Za odvajanje metabolita korištena je ACQUITY BEH Amide kolona (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Mobilna faza se sastojala od 90% (A) i 5% acetonitrila (B) s 10 mmol/L amonijum acetata i 0,1% otopine amonijaka. Gradijentni program je bio sljedeći: 0–1,5 min, 0% B; 1,5–6,5 min, 0–15% B; 6,5–8 min, 15% B; 8–8,5 min, 15%–0% B; 8,5–11,5 min, 0% B. Kolona je održavana na 40 °C, a uzorak na 10 °C u autosampleru. Brzina protoka bila je 0,3 mL/min, a volumen ubrizgavanja 1 μL. MS parametri su postavljeni na sljedeći način: kapilarni napon ±3,5 kV, pritisak u nebulizatoru 35 psi, protok plina omotača 12 L/min, temperatura plina omotača 350 °C, temperatura plina za sušenje 250 °C i protok plina za sušenje 14 l/min. MRM konverzije triptofana, piruvata, laktata, hipoksantina i ksantina bile su 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 i 151,0–107,9 respektivno. Podaci su prikupljeni korištenjem Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Za uzorke seruma, triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin i ksantin su kvantificirani korištenjem kalibracijskih krivulja standardnih smjesa otopina. Za uzorke ćelija, sadržaj triptofana je normaliziran na interni standard i masu ćelijskih proteina.
Ekstrakcija vrha (m/z i vrijeme zadržavanja (RT)) izvršena je korištenjem Compound Discovery 3.1 i TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Da bi se eliminirale potencijalne razlike između serija, svaki karakteristični vrh testiranog uzorka podijeljen je karakterističnim vrhom referentnog materijala iz iste serije kako bi se dobila relativna abundancija. Relativne standardne devijacije internih standarda prije i poslije standardizacije prikazane su u Dodatnoj tabeli 6. Razlike između dvije grupe karakterizirane su stopom lažnih otkrića (FDR<0,05, Wilcoxon test predznačenih rangova) i promjenom struka (>1,2 ili <0,83). Sirovi MS podaci ekstrahiranih karakteristika i MS podaci korigovani za referentni serum prikazani su u Dodatnim podacima 1 i Dodatnim podacima 2. Anotacija vrha izvršena je na osnovu četiri definirana nivoa identifikacije, uključujući identificirane metabolite, navodno anotirane spojeve, navodno karakterizirane klase spojeva i nepoznate spojeve 22. Na osnovu pretraga baze podataka u Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), biološki spojevi sa MS/MS podudarajućim validiranim standardima ili tačnim podudaranjima u mzCloudu (rezultat > 85) ili Chemspideru konačno su odabrani kao međuprodukti između diferencijalnog metaboloma. Anotacije vrhova za svaku karakteristiku uključene su u Dopunskim podacima 3. MetaboAnalyst 5.0 korišten je za univarijantnu analizu količine metabolita normalizirane sumom. MetaboAnalyst 5.0 je također procijenio analizu obogaćivanja KEGG puta na osnovu značajno različitih metabolita. Analiza glavnih komponenti (PCA) i diskriminantna analiza parcijalnih najmanjih kvadrata (PLS-DA) analizirane su korištenjem softverskog paketa ropls (v.1.26.4) sa normalizacijom steka i automatskim skaliranjem. Optimalni model biomarkera metabolita za predviđanje maligniteta nodula generiran je korištenjem binarne logističke regresije s najmanjim apsolutnim smanjenjem i operatorom selekcije (LASSO, R paket v.4.1-3). Performanse diskriminantnog modela u setovima za detekciju i validaciju okarakterisane su procjenom AUC-a na osnovu ROC analize prema pROC paketu (v.1.18.0.). Optimalna granična vrijednost vjerovatnoće dobijena je na osnovu maksimalnog Youdenovog indeksa modela (osjetljivost + specifičnost – 1). Uzorci sa vrijednostima manjim ili većim od praga biće predviđeni kao benigni noduli i adenokarcinom pluća, respektivno.
Ćelije A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) uzgajane su u F-12K mediju koji sadrži 10% FBS-a. Sekvence kratke ukosnice RNK (shRNA) usmjerene na SLC7A5 i neciljanu kontrolu (NC) umetnute su u lentivirusni vektor pLKO.1-puro. Antisense sekvence shSLC7A5 su sljedeće: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Antitijela na SLC7A5 (#5347) i tubulin (#2148) kupljena su od Cell Signaling Technology. Antitijela na SLC7A5 i tubulin korištena su u razrjeđenju 1:1000 za Western blot analizu.
Seahorse XF test glikolitičkog stresa mjeri nivoe ekstracelularne acidifikacije (ECAR). U testu su glukoza, oligomicin A i 2-DG primijenjeni sekvencijalno kako bi se testirao ćelijski glikolitički kapacitet mjeren ECAR-om.
A549 ćelije transficirane neciljanom kontrolom (NC) i shSLC7A5 (Sh1, Sh2) su nasađene preko noći u posude promjera 10 cm. Ćelijski metaboliti su ekstrahirani sa 1 ml ledeno hladnog 80% vodenog metanola. Ćelije u metanolnom rastvoru su sastrugane, sakupljene u novu epruvetu i centrifugirane na 15.000 × g tokom 15 minuta na 4°C. Sakupite 800 µl supernatanta i osušite pomoću brzog vakuumskog koncentratora. Osušene pelete metabolita su zatim analizirane na nivoe triptofana pomoću LC-MS/MS kao što je gore opisano. Ćelijski nivoi NAD(H) u A549 ćelijama (NC i shSLC7A5) su mjereni korištenjem kvantitativnog NAD+/NADH kolorimetrijskog kompleta (#K337, BioVision) prema uputama proizvođača. Nivoi proteina su mjereni za svaki uzorak kako bi se normalizirala količina metabolita.
Nisu korištene statističke metode za preliminarno određivanje veličine uzorka. Prethodne metabolomske studije usmjerene na otkrivanje biomarkera15,18 smatrane su referentnim vrijednostima za određivanje veličine i, u poređenju s tim izvještajima, naš uzorak je bio adekvatan. Nijedan uzorak nije isključen iz studijske kohorte. Uzorci seruma su nasumično dodijeljeni grupi za otkrivanje (306 slučajeva, 74,6%) i internoj validacijskoj grupi (104 slučaja, 25,4%) za neciljane metabolomske studije. Također smo nasumično odabrali 70 slučajeva iz svake grupe iz skupa za otkrivanje za ciljane metabolomske studije. Istraživači nisu bili upoznati s dodjeljivanjem grupa tokom prikupljanja i analize LC-MS podataka. Statističke analize metabolomskih podataka i ćelijskih eksperimenata opisane su u odgovarajućim odjeljcima Rezultati, Legende slika i Metode. Kvantifikacija ćelijskog triptofana, NADT-a i glikolitičke aktivnosti izvršena je tri puta nezavisno s identičnim rezultatima.
Za više informacija o dizajnu studije, pogledajte sažetak izvještaja o prirodnom portfoliju povezan s ovim člankom.
Sirovi MS podaci ekstrahovanih karakteristika i normalizovani MS podaci referentnog seruma prikazani su u Dodatnim podacima 1 i Dodatnim podacima 2. Anotacije vrhova za diferencijalne karakteristike predstavljene su u Dodatnim podacima 3. Skup podataka LUAD TCGA može se preuzeti sa https://portal.gdc.cancer.gov/. Ulazni podaci za crtanje grafikona dati su u izvornim podacima. Izvorni podaci dati su za ovaj članak.
Nacionalna grupa za proučavanje plućnog skrininga, itd. Smanjenje smrtnosti od raka pluća kompjuterizovanom tomografijom niskih doza. Sjeverna Engleska. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR i Prophet, PC. Skrining raka pluća korištenjem niskodoznog spiralnog CT-a: rezultati Nacionalne studije skrininga pluća (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Smanjenje smrtnosti od raka pluća volumetrijskim CT skriningom u randomiziranom ispitivanju. Sjeverna Engleska. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Vrijeme objave: 18. septembar 2023.