Klasterisana regularno isprepletena kratka palindromska ponavljanja (CRISPR) su tehnika uređivanja genoma treće generacije koja je revolucionirala svijet svojim visokopropusnim rezultatima. Koristi se za liječenje raznih bioloških bolesti i infekcija. Razne bakterije i drugi prokarioti (kao što su arheje) također imaju CRISPR/Cas9 sisteme za odbranu od faga. Prijavljeno je da strategije zasnovane na CRISPR/Cas9 mogu inhibirati rast i napredovanje trostruko negativnog raka dojke (TNBC) ciljajući potencijalno izmijenjene gene otpornosti, transkripciju i epigenetičku regulaciju. Ove terapijske intervencije mogu pomoći u rješavanju izazovnih problema kao što je otpornost na lijekove koja se uočava čak i kod TNBC. Trenutno se koriste različite metode za isporuku CRISPR/Cas9 ciljnim ćelijama, kao što su fizičke (mikroinjekcija, elektroporacija i hidrodinamički načini), virusne (adeno-asocirani virus i lentivirus) i nevirusne (liposomi i lipidne nanočestice). Iako su razvijeni različiti modeli za proučavanje molekularnih uzroka TNBC-a, nedostatak osjetljivih i ciljanih metoda za isporuku alata za uređivanje genoma in vivo ograničava njihovu kliničku primjenu. Ukratko, ovaj pregled sveobuhvatno ispituje napredak, izazove, ograničenja i perspektive CRISPR/Cas9 tretmana za TNBC na osnovu postojećih dokaza. Također ističemo kako kombinacija umjetne inteligencije i mašinskog učenja može poboljšati CRISPR/Cas9 strategije u liječenju TNBC-a.
Rak karakterizira nekontrolirana dioba ćelija, poremećaj kontrolnih tačaka ćelijskog ciklusa i mutacije u genima supresora tumora (TSG) (Matthews et al., 2022). Među različitim vrstama raka, rak dojke je najčešći tip raka kod žena i ima visoku stopu smrtnosti širom svijeta (Waks i Winer, 2019). Rak dojke je heterogena bolest s različitim karakteristikama, kao što su histološke i biološke karakteristike, klinička slika i ponašanje, te odgovor na liječenje (Weigelt et al., 2010). Klasifikacija raka dojke pruža precizan uvid u dijagnozu raka dojke i prognozu tumora. Upotreba uobičajenih biomarkera i kliničkopatoloških karakteristika bila je glavni kriterij za klasifikaciju raka dojke (Tsang i Tse, 2019). Na prognozu i odgovor na liječenje raka dojke utječu brojni faktori, uključujući prisustvo estrogenskog receptora (ER), progesteronskog receptora (PR), receptora 2 humanog epidermalnog faktora rasta (HER2/neu), te histološki gradus, tip i gradus tumora, veličinu i metastaze u limfnim čvorovima (Al-Tubaiti, 2020). Identificirano je pet intrinzičnih molekularnih podtipova raka dojke, uključujući luminalni A, luminalni B, obogaćeni HER2, bazalni i klaudinski nisko (Prat et al., 2015). TNBC je molekularni podtip raka koji ne eksprimira sve ER, PR i HER2 (Yin et al., 2020). Ove patološke karakteristike povezane su sa TNBC, što potvrđuje njegovu brzu progresiju i agresivniju prirodu od bilo koje druge vrste raka dojke (Feng et al., 2018). Osim toga, Peru i sar. (2000) koristili su tehnologiju mikročipova za reklasifikaciju raka dojke i identifikaciju pet intrinzičnih podtipova raka dojke (Cadenas, 2012). Bazalni karcinom dojke je podtip raka dojke koji ima trostruko negativni fenotip i povezan je s brzom progresijom. Treba napomenuti da se svi bazalni karcinomi dojke često pogrešno dijagnosticiraju kao TNBC, ali samo 77% su TNBC; Nasuprot tome, 71–91% TNBC-a su bazalni, što ukazuje na to da se ova dva tipa raka dojke preklapaju i predstavljaju različite klasifikacije (Wang D.-Y. et al., 2019). To stvara potrebu za karakterizacijom heterogenosti TNBC-a kako bi se razjasnila prognoza i identificirali potencijalni odgovori na trenutne i buduće tretmane. Osim toga, TNBC čini 15–20% svih slučajeva raka dojke i češći je kod žena mlađih od 50 godina. Mutacije BRCA1 ili BRCA2 prijavljene su u približno 20% slučajeva TNBC-a (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). Studije su također pokazale da TNBC ima različito imunološko mikrookruženje koje uključuje visoke nivoe faktora rasta vaskularnog endotela, makrofage povezane s tumorom (TAM), limfocite koji infiltriraju tumor (TIL) i druge molekule uključene u rast i migraciju tumora. Stoga je razumijevanje mikrookruženja TNBC-a ključno za njegovu prognozu i liječenje (Fan i He, 2022).
Da bi se procijenila prognoza TNBC-a i osiguralo efikasno liječenje, važna je tačna dijagnoza, uglavnom zasnovana na imunohistohemiji (IHC) za detekciju ER, PR i HER2, te mamografija za detekciju neoplazmi dojke. Međutim, mamografija ne može adekvatno prikazati intratumoralne karakteristike poput nekroze i fibroze (Deepak Singh et al., 2021). Budući da loša prognoza i dijagnoza sprječavaju ljekare da propišu prave lijekove (Chaudhary, 2020), koriste se različite strategije za poboljšanje njege pacijenata sa TNBC-om. Trenutno se dva lijeka, doksorubicin i ciklofosfamid, koriste kod pacijenata sa TNBC-om i pokazala su dobre rezultate. Pored toga, koriste se i drugi lijekovi platine, poput karboplatina i cisplatina (Sikov et al., 2015). Pored toga, inhibitori PARP-a poput Olapariba, Velapariba i PF-01367338 korišteni su kao potencijalni hemoterapijski lijekovi za liječenje TNBC-a (Ishino et al., 2018). Budući da je utvrđeno da su Wnt/b-Catenin, NOTCH i Hedgehog signalni putevi uključeni u nastanak i progresiju TNBC-a, ciljanje lijekova na ove puteve može biti važna strategija (Aysola et al., 2013). Iako hirurgija, radioterapija i hemoterapija ostaju glavni oslonac liječenja TNBC-a danas, postignut je značajan napredak u razvoju novih tretmana, uključujući ciljanu terapiju, imunoterapiju, različite alate za uređivanje gena povezane s CRISPR-om, kao što su Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, primarno uređivanje i gensku terapiju usmjerenu na CRISPR/Cas9. Ovdje ćemo se fokusirati na različite alate za uređivanje gena povezane s CRISPR-om koji se koriste u liječenju TNBC-a. Među njima, CRISPR/Cas9 je privukao široku pažnju.
Cas9n, također poznat kao Cas9 nikaza, je genetski modificirana varijanta proteina Cas9 izvedena iz sistema za uređivanje genoma CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). U svom izvornom obliku, protein Cas9 sadrži dva nukleazna domena: RuvC i HNH, čija je glavna funkcija cijepanje oba lanca DNK. Međutim, kod Cas9n, jedan od nukleaznih domena, HNH, je genetski mutiran i postaje neaktivan. Stoga, HNH domen Cas9n ostaje nefunkcionalan. Samo RuvC domen ostaje aktivan, što omogućava Cas9n-u da reže ili stvara prekide na pojedinačnim lancima DNK (Trevino i Zhang, 2014). U poređenju sa Cas9, Cas9n može efikasno smanjiti efekte van cilja i precizno poboljšati mehanizme popravke ćelija. Cas9n se može koristiti za rješavanje različitih problema, kao što je stvaranje prekida na određenim lokacijama u dvolančanoj DNK. U tu svrhu, dva molekula Cas9n su kombinovana i korištena zajedno (Yee, 2016). Kinaza miješane loze 3 (MLK3) je protein kinaza aktivirana mitogenom koja služi kao ključni regulator tokom metastaza TNBC-a (Cronan et al., 2012).
MLK3 može aktivirati više signalnih puteva koji dovode do metastaza TNBC-a. Na primjer, put c-Jun N-terminalne kinaze (JNK) reguliše pokretljivost ćelija i degradaciju ekstracelularnog matriksa, a MLK3 aktivira JNK put, čime poboljšava pokretljivost ćelija i daje invazivna svojstva (Rattanasinchai i Gallo, 2016). MLK3 također reguliše EMT. Da bi to učinio, aktivira nizvodne transkripcione faktore kao što su Snail, Slug i Twist. Ovi faktori inhibiraju ekspresiju epitelnih markera i promoviraju ekspresiju mezenhimalnih markera, što dovodi do sticanja metastatskog fenotipa (Casalino et al., 2023). Uočeno je da MLK3 igra ulogu u remodeliranju ECM-a i aktivaciji proteaza kao što su matrične metaloproteinaze (MMP) koje degradiraju ECM. To olakšava invaziju tumorskih ćelija i širenje na udaljena mjesta (Katari et al., 2019). Dakle, prethodne studije su pokazale da MLK3 igra ključnu ulogu u TNBC-u. Rattanasinchai i Gallo koristili su TNBC modele za proučavanje uloge MLK3 i otkrili da on potiče razvoj raka putem specifičnih signalnih puteva. Koristili su CRISPR/Cas9n za uređivanje MLK3 i uočili značajno smanjenje metastaza TNBC-a (Rattanasinchai i Gallo, 2016).
dCas9, često nazivan neaktivnim Cas9, je modificirani derivatni oblik Cas9 proteina. Za razliku od aktivnog Cas9, dCas9 nema endonukleaznu aktivnost, što ga čini nesposobnim da indukuje dvostruke prekide DNK lanca. Stoga se dCas9 može koristiti za precizno ciljanje specifičnih regija genoma bez ikakvih promjena ili modifikacija DNK sekvence (Wang et al., 2016). U dCas9, dva endonukleazna proteina, RuvC i HNH, su inaktivirana potiskivanjem važnih aminokiselinskih ostataka. (Richter et al., 2016). Uprkos nedostatku aktivnosti cijepanja DNK, dCas9 igra niz važnih uloga u genetskim istraživanjima i biotehnologiji. Na primjer, omogućava vizualizaciju specifičnih regija genoma, olakšava transkripcijsku regulaciju i promovira epigenetičke modifikacije (Brocken et al., 2018).
Transkripcijski faktor ZEB1 (cinkov prst E-box binding homeobox 1) igra specifičnu i ključnu ulogu u posredovanju epitelno-mezenhimalne tranzicije (EMT), ćelijskog procesa koji se odvija tokom embrionalnog razvoja, popravke tkiva i progresije raka. Uključuje transformaciju epitelnih ćelija u mezenhimalne ćelije, što rezultira promjenama u morfologiji ćelija, pokretljivosti, invazivnosti itd. (Wu et al., 2020). ZEB1 inhibira više epitelnih markera, kao što su E-kadherin i okludin, koji su odgovorni za održavanje ćelijske adhezije i polariteta epitelnih ćelija u TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Osim toga, ZEB1 aktivira određene markere kao što su N-kadherin, vimentin i fibronektin (Konradi et al., 2014), a također reguliše gene uključene u remodeliranje citoskeleta kao što su Rho GTPaze i matriksne metaloproteinaze (MMP) (Huang et al., 2014). 2022), pored toga, utiče i na različite signalne puteve kao što su transformirajući faktor rasta-β (TGF-β), Wnt signalizacija itd., čime se potiče invazija tumora i metastaze kod TNBC (Chen et al., 2016). Brojne studije i naučni dokazi ukazuju na to da ZEB1 ima veliki potencijal kao vrijedno sredstvo za detekciju i terapijsku intervenciju TNBC. U nedavnoj studiji, Waryah i saradnici koristili su TNBC model i postigli potpunu supresiju ZEB1 pomoću dCas9. Tako su uočili vrlo visoku specifičnost i gotovo potpunu inhibiciju ZEB1 u in vivo uslovima (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 je alat za uređivanje gena pod nazivom CRISPR/Cpf1. Izveden je iz CRISPR/Cas sistema, gdje se termin Cas12 odnosi na CRISPR-povezani protein 12 (Bharathkumar et al., 2022), koji je potpuno sličan Cas9. Jedina razlika je što sadrži protein Cas12. U poređenju sa Cas9, Cas12 ima neke jedinstvene funkcije kao što je generiranje ljepljivih krajeva tokom procesa uređivanja gena, dok Cas9 generira tupe krajeve (Wang et al., 2021). Ovo svojstvo Cas12 doprinosi njegovoj specifičnoj tehnologiji manipulacije DNK. Kao protein sposoban za precizno prepoznavanje i rezanje ciljne DNK, ima izvanrednu svestranost, što ga čini efikasnim alatom za različite primjene, uključujući uređivanje gena (Pickar-Oliver i Gersbach, 2019).
Slično drugim CRISPR varijantama, CRISPR/Cas12 je također sposoban da eliminiše ili aktivira gene u TNBC-u, ciljajući gene koji igraju važnu ulogu u njegovoj patogenezi ili odgovoru na liječenje (Yang i Zhang, 2023). Da bi se postigao ovaj proces, razvijena je vodička RNK (gRNA) koja usmjerava Cas12 na ciljni gen. Nakon što se Cas12 veže za svoj cilj, uvodi dvostruke prekide u DNK i aktivira mehanizme popravka DNK. Tokom procesa popravka, mogu se ugraditi pogrešni nukleotidi, što dovodi do mutacija gena i gubitka funkcije (Zhang et al., 2021a). Osim toga, poboljšana verzija enzima Cas12 (nazvana dCas12) također je korištena za aktiviranje gena. Kombinacijom s aktivatorom transkripcije moguće je inducirati određene gene, čime ih aktivirati. Ova tehnologija ima veliki potencijal u promovisanju aktivacije gena supresora tumora (Sultan et al., 2022).
Prime editovanje je novo razvijena i izuzetno superiorna tehnologija uređivanja genoma. Sposobna je da vrlo precizno modificira DNK organizma (Chen i Liu, 2023). Prime editovanje se postiže integracijom dvije glavne komponente: modificiranog enzima CRISPR/Cas9 i reverzne transkriptaze. Uloga enzima CRISPR/Cas9 je selektivno ciljanje preciznih mjesta u genomu, dok reverzna transkriptaza pomaže u temeljitoj modifikaciji DNK na ciljnoj lokaciji (Hassan et al., 2021). U mehanizmu uređivanja primera, prvi korak uključuje stvaranje RNK vodiča za uređivanje primera (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Sadrži ciljnu sekvencu i RNK predložak koji odgovara željenom mjestu uređivanja u ciljnoj DNK. PegRNA se zatim uvodi u ciljne ćelije zajedno s nukleazom za uređivanje primera (PE2). PE2 je fuzijski protein koji se sastoji od enzima Cas9, reverzne transkriptaze i adaptera za uređivanje primera (Martín-Alonso et al., 2021). Unutar ćelije, pegRNA i PE2 kompleksi traže specifičnu DNK koju žele modificirati. Enzim Cas9 reže DNK i stvara predložak koji se sastoji od pojedinačnih lanaca (Choi et al., 2022). Reverzna transkriptaza koristi ovaj predložak za pripremu DNK za uređivanje. Uz kopiranje DNK, uključene su i upute za uređivanje RNK predloška. Konačno, novostvoreni lanac DNK se koristi kao predložak za popravak prekida u DNK, što rezultira izmijenjenom sekvencom DNK koja sadrži željenu modifikaciju (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Mehanizmi uređivanja primera mogu dovesti do široko rasprostranjenih mutacija u genima. Mogu ciljati tačkaste mutacije, insercije, delecije, pa čak i zamjene gena (Anzalone et al., 2019; Chen i Liu, 2023). Prime uređivanje nudi nekoliko prednosti u odnosu na prethodne tehnologije uređivanja genoma. To uključuje povećanu tačnost, smanjene efekte izvan cilja i mogućnost uređivanja DNK bez oslanjanja na dvostruke prekide lanca DNK (Anzalone et al., 2020).
CRISPR/Cas9 tehnologija je prvobitno razvijena za zaštitu bakterija od transfera plazmida i fagnih infekcija, a kasnije je prenamijenjena kao efikasan alat za ciljanje DNK zasnovan na RNK za uređivanje genoma (Jiang i Doudna, 2017). Osim toga, zabilježeno je da je CRISPR/Cas9 sistem prisutan u 50% odnosno 87% bakterijskih i arhealnih genoma (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 je potencijalni alat za brisanje, umetanje i korekciju bilo koje abnormalne genetske sekvence korištenjem in vivo i in vitro načina rada (Sabit et al., 2021). Štaviše, pokazalo se da je CRISPR/Cas9 dio adaptivnog imunološkog sistema zbog svoje specifičnosti za ciljne gene od interesa (Chen i Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 se sastoji od Cas9 i jedne vodičke RNK (sgRNA). Cas9 je endonukleaza sastavljena od više proteinskih komponenti. Osim toga, Cas9 ima jedinstvena strukturna i konformacijska svojstva (Pacesa et al., 2022) jer se sastoji od dva režnja: režnja za prepoznavanje (REC) i nukleaze (NUC). REC režanj je dalje podijeljen na tri regije: REC1, REC2 i mostne helikse (Cromwell et al., 2018). NUC se sastoji od tri režnja, i to RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH i domena interakcije susjednog motiva protospacera (PAM) (Slika 1) (Song et al., 2016). sgRNA se sastoji od dvije komponente, uključujući CRISPR RNK (crRNA) i transkodirajuću malu RNK (tracer RNK) (Slika 1). SgRNA povezuje protein Cas9 sa koneksinima formirajući aktivni kompleks, također poznat kao efektorski kompleks (Richter et al., 2012). crRNA je bazni par od 18-20 nukleotida koji igra ključnu ulogu u prepoznavanju ciljnih sekvenci DNK. Osim toga, crRNA se uparuje sa ciljnom DNK, a tracrRNA djeluje kao skela za nukleazu Cas9 da se veže za ciljnu DNK (Manghwar et al., 2019). S druge strane, PAM sekvenca ima 3 nukleotida, što potvrđuje, specificira i posreduje vezivanje efektorskog kompleksa za DNK. Podjedinice RuvC i HNH proteinskog kompleksa Cas9 imaju katalitičku aktivnost (Richter et al., 2012; Asmamaw i Zawdie, 2021). HNH nukleazni domen Cas9 podjedinice cijepa lanac DNK povezan sa crRNA. Nukleazni domen RuvC cijepa druge lance DNK i generira dvostruke prekide lanca (DSB), nakon čega se aktiviraju dva različita mehanizma za popravak prekida DNK (Jiang i Doudna, 2017) (Slika 1).
Slika 1. Pregled CRISPR/Cas9 (A). Komponente CRISPR/Cas9 sistema: (i). Cas9 endonukleaza je odgovorna za rezanje ciljne DNK sekvence, (ii) jedna vodička (sg) RNK koja nastaje fuzijom crRNA i tra-crRNA himera. (dvije). Cas9 uključuje nekoliko komponenti kao što su Rec I, Rec II, NUC režanj (HNH i Ruv C su podkomponente) i PAM domen interakcije (C) sa odgovarajućim funkcijama. CRISPR/Cas9 proteinski kompleks cijepa DNK sekvence u nekomplementarne i komplementarne oblike (D). CRISPR/Cas9 uređuje genom u tri faze: prepoznavanje, rezanje i popravak. Dizajnirana sg-RNK vodi Cas9 i prepoznaje željenu sekvencu putem komplementarne komponente crRNA. Cas9 prepoznaje PAM sekvencu na 5′-NGG-3′ i topi DNK, formirajući DNK-RNK hibrid i aktivirajući cijepanje. HNH domen Cas9 cijepa komplementarni lanac, a RuvC domen cijepa nekomplementarni lanac. CRISPR/Cas9 popravlja dvolančanu DNK prekidajući je na dva načina: spajanjem nehomolognih krajeva (NHEJ) i popravkom usmjerenom na homologiju (HDR). NHEJ popravlja dvolančanu DNK u odsustvu strane homologne DNK putem enzimskog procesa, mehanizma sklonog greškama koji može umetnuti ili ukloniti nasumične sekvence DNK. HDR je vrlo specifičan i zahtijeva homologne DNK kalupe.
CRISPR/Cas9-posredovani putevi popravke uključuju mehanizme nehomolognog spajanja krajeva (NHEJ) i homologno usmjerenog popravka (HDR). NHEJ je put sklon greškama jer uključuje umetanje ili brisanje i ne zahtijeva nikakav obrazac tokom mehanizma popravke. Koristi nasumične nukleotide za generiranje standardnih proteina (Abbasi et al., 2021). Ovaj sistem popravke sastoji se od četiri kompleksa kao što su KU kompleks, unakrsno komplementirajući proteinski kompleks tipa 4 (XRCC-4), enzim za obradu DNK krajeva i protein kinaza DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Protein KU kompleksa ima dvije podjedinice, Ku 70 i Ku 80, i igra važnu ulogu u NHEJ mehanizmu, budući da se mehanizam popravka pokreće vezivanjem dvije podjedinice (Ku 70 i Ku 80) za tupe ili gotovo tupe krajeve ciljne DNK (Abbasi et al., 2021), služeći kao skela za regrutovanje drugih faktora povezanih s NHEJ-om na mjesto oštećenja (Yang et al., 2020). XRCC-4 i DNA ligaza sastoje se od 334, odnosno 911 aminokiselina, a kompleks XRCC4-DNA ligaza IV stimulira ligaciju krajeva DNK (Chatterjee et al., 2015). Enzim za obradu krajeva DNK, također poznat kao polinukleotid kinaza 3'-fosfat, je enzim za obradu krajeva DNK. Može ukloniti 3'P grupu u DNK i fosforilirati 5'OH grupu tokom popravka DSB-a. Također uključuje popravak jednolančanih prekida (SSB) korištenjem SSB puta popravka (Chatterjee et al., 2015). Proteinska kinaza DNA-PKcs je DNK-ovisna proteinska kinaza koja se sastoji od katalitičke podjedinice PIKK-ova (kinaze povezane s fosfatidilinozitolom 3-kinazom) i porodice ataksija telangiektazija mutiranih (ATM), kao i ATR-ova povezanih s ATM-om i Rad3, prekida lanca (DSB) i jednolančanih prekida (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR je precizniji i prikladniji mehanizam popravke jer se informacije kopiraju korištenjem netaknutog oblika homolognog DNK dupleksa, iako je potrebno prisustvo sestrinskih hromatida. Ovo se dešava tokom S/G2 faze ćelijskog ciklusa sisara. HDR se javlja uglavnom kod vrsta kvasca, ali NHEJ je ključan kod sisara (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Kompletan mehanizam popravke prikazan je na Slici 1.
Budući da je TNBC uzrokovan genetskim i epigenetičkim abnormalnostima, korekcija malignih genomskih/epigenomskih abnormalnosti korištenjem CRISPR/Cas9 može biti razuman terapijski pristup (Chen et al., 2019). Osim toga, neki transkripcijski faktori uključeni u ćelijski specifičnu transkripcijsku regulaciju mogu pokazivati jedinstvene karakteristike ćelija raka, što sugerira da transkripcijska regulacija može biti odličan pristup liječenju raka (Drost et al., 2017). Iskorištavanje ovih molekularnih karakteristika tumora, kao što su genetski, epigenetički i transkripcijski defekti, za razvoj lijekova može poboljšati kliničke ishode i smanjiti troškove skrininga. CRISPR je potencijalni alat za uređivanje gena koji ne samo da može otkriti i identificirati genomske ciljeve koji uzrokuju rak, već se može koristiti i za uređivanje, supresiju i epigenetičku modifikaciju onkogena u ljudskim ćelijama (Tabela 1) (Ahmed et al., 2021). Nekoliko CRISPR skrininga je provedeno kako bi se pronašli geni povezani sa tumorskim supresorima, onkogenima i otpornošću na lijekove. Upotreba CRISPR/Cas9 za uređivanje različitih TNBC onkogena prikazana je na Slici 2.
Slika 2. Uređivanje gena različitih onkogena TNBC-a korištenjem CRISPR/Cas9 tehnologije rezultira smanjenim rastom tumora i metastazama. Ovi onkogeni uključuju CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 i CXCR7, Crypto1, ROR1 i ST8SIA, koji su uključeni u pojavu i metastaze TNBC-a.
Migracija, invazija i epitelno-mezenhimalna tranzicija (EMT) ćelija raka povezani su s ITGA9. Prethodne studije su pokazale da je ITGA9 ključni igrač u Notch putu i igra zanimljivu ulogu u metastazama rabdomiosarkoma (Molist et al., 2020). Osim toga, utvrđeno je da je ITGA9 usko povezan s prognozom pacijenata kod nekoliko tipova tumora, uključujući rak dojke (Wang Z. et al., 2019). Osim toga, bioinformatička analiza ITGA9 pokazala je da je njegova ekspresija u TNBC-u značajno veća nego kod drugih podtipova raka dojke. Povišeni nivoi ITGA9 povezani su s metastazama tumora i relapsom kod pacijenata s TNBC-om. Nokautiranje ITGA9 pomoću CRISPR/Cas9 rezultiralo je svojstvima sličnim matičnim ćelijama raka (CSC), angiogenezom tumora, rastom tumora i smanjenjem metastaza promoviranjem degradacije β-katenina u TNBC-u (Wang Z. et al., 2019).
Kripto-1 je član TGF-β porodice i ključan je za ranu embriogenezu, održavanje matičnih ćelija i metastaze raka (Ishii et al., 2021). Također poznat kao Tdgf-1, to je onkogeni GPI-usidreni signalni protein koji učestvuje u regulaciji formiranja primitivne pruge, mezoderma i endoderma, kao i u uspostavljanju lijeve/desne asimetrije u razvoju tjelesnih organa tokom embriogeneze (Zhang et al., 2021b). Osim toga, pokazalo se da je Cripto-1 uključen u epitelno-mezenhimalnu tranziciju (EMT) kao marker matičnih ćelija (Zhang et al., 2021b). EMT je ključan ne samo za različite procese kao što su embrionalni razvoj, fibroza i zacjeljivanje rana, već i za invaziju i metastaze raka. Osim toga, pokazalo se da Cripto-1 interaguje sa četiri Notch receptora i poboljšava njihovo posttranslaciono sazrijevanje (Brandstadter i Maillard, 2019). Poznato je da je Notch signalni put uključen u održavanje ljudskih ćelija raka dojke. Studije su pokazale da CRISPR/Cas9-posredovano nokautiranje Crypto-1 potiskuje rast i metastaze raka. Stoga, Crypto-1 može postati važna terapijska meta za TNBC (Castro et al., 2015).
Protein XCL12 i njegov hemokinski receptor CXC (CXCR4 i CXCR7) igraju različite uloge u proliferaciji, rastu, migraciji i invaziji ćelija raka (Wu et al., 2015). Ovi hemoreceptori su povezani s razvojem TNBC-a putem višestrukih signalnih puteva i u in vivo i in vitro modelima (Wu et al., 2015). Osim toga, aktivacija CXCR4 i CXCR7 povezana je s većom podložnošću metastazama i lošom prognozom kod TNBC-a (Karn et al., 2022). Stoga, nokautiranje CXCR4 i CXCR7 može postati efikasni ciljni geni lijekova za liječenje raka dojke, uključujući TNBC. Studija Yang-a i saradnika. Yang i saradnici (2019) koristili su CRISPR/Cas9 za ko-nokautiranje gena CXCR4 i CXCR7 i otkrili da su proliferacija, rast, migracija i invazija TNBC-a značajno inhibirani (Yang et al., 2019).
Povećani nivoi miR-3662, onkogena TNBC-a, uočeni su u tkivima raka dojke (Yi et al., 2022). Pokazalo se da eliminacija miR-3662 inhibira rast i metastaze tumora raka dojke i in vivo i in vitro (Agarwal i Gupta, 2021). HBP-1 je snažan inhibitor Wnt/-katenin signalizacije i vjerovatno je odgovoran za rast TNBC ćelija posredovan miR-3662. Nedavno su Yi i saradnici otkrili da osa miR-3662-HBP1 reguliše Wnt/-katenin signalni put u TNBC ćelijama (Yi et al., 2022). Zbog svoje specifične ekspresije za tumor, miR-3662 može biti potencijalna terapijska meta za TNBC. Stoga, eliminacija miR-3662 posredovana CRISPR/Cas9 može biti odličan pristup za razvoj novih lijekova za liječenje TNBC-a.
UBR5 je nukleofosfoprotein od 300 kDa koji je identificiran kao ključni regulator tumorogeneze, metastaza i imunološkog odgovora kod različitih vrsta raka (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Prijavljeno je da je UBR5 visoko pojačano reguliran u uzorcima TNBC-a i stimulira ERα funkciju inducirajući proliferaciju putem svoje aktivnosti ubikvitin ligaze (Bolt et al., 2015). Studije sekvenciranja cijelog egzoma primarnih uzoraka TNBC-a također su pokazale povećanu ekspresiju UBR5, što ukazuje na njegovu ulogu u razvoju TNBC-a. Osim toga, delecija UBR5 uzrokovana CRISPR/Cas9 pokazala je značajnu inhibiciju metastaza i rasta TNBC-a u eksperimentalnim modelima miševa. Štaviše, uključivanje UBR5 u model miša divljeg tipa vratilo je njegovu punu funkcionalnost, dok ovaj učinak nije uočen kod inaktiviranih mutantnih sojeva (Liao et al., 2017). Nedostatak UBR5 povezan je sa povećanom apoptozom, nekrozom i inhibicijom rasta tumora kod TNBC-a zbog slabe angiogeneze. Zbog gubitka UBR5, širenje tumora na udaljene organe je smanjeno, a UBR5 indukuje abnormalni EMT uglavnom smanjenjem ekspresije E-kadherina (Zhang i Weinberg, 2018). Nedavno se pokazalo da je UBR5 vrlo važan faktor u transkripciji PDL1 indukovanoj IFN-γ kod TNBC-a zbog nedostatka aktivnosti ubikvitinacije E3. Analiza RNA transkriptoma otkrila je da UBR5 može imati sistemske efekte na gene povezane s IFN-γ putem i promovirati transaktivaciju PDL1 povećanjem nivoa aktivacije protein kinaze RNA (PKR) i njenih signalnih transduktora i aktivatora transkripcije 1 (STAT1) i regulatornog faktora interferona 1 (IRF1). Međutim, kombinovana ablacija UBR5 i ekspresije PD-L1 posredovana CRISPR/Cas9 ima sinergistički terapijski efekat od bilo koje blokade zasebno, sa dubokim efektima na mikrookruženje tumora (Wu et al., 2022). Stoga, CRISPR/Cas9 može biti važan alat za inhibiciju funkcije UBR5, čime se suzbijaju metastaze TNBC-a i rast tumora.
ROR1 je transmembranski protein tipa I koji se eksprimira tokom raka i embrionalnog razvoja, a identificiran je kao onkofetalni protein (Nicholas Borcherding, 2014). Invazivno ponašanje različitih ljudskih karcinoma povezano je s pojačanom regulacijom ROR1. Obećavajući rezultati dobiveni su iz in vivo i in vitro studija koje uključuju terapijske spojeve usmjerene na ROR1 (Chien et al., 2016). Povišeni nivoi ROR1 mRNA u biopsijama tkiva dojke također su povezani s agresivnim bazalnom tumorima dojke (BL) i njihovom migracijom u druge dijelove tijela. Štaviše, prekomjerna ekspresija ROR1 identificirana je kao prognostički marker za razvoj TNBC-a (Chien et al., 2016). Međutim, utišavanje ROR1 pomoću CRISPR/Cas9 za suzbijanje rasta i metastaza TNBC-a bila bi efikasna strategija.
Proces sialilacije uključuje dodavanje sijalinske kiseline glikokonjugatima, što kataliziraju sijaliltransferaze (ST). ST8SIA1 pripada ST porodici i igra važnu ulogu u patogenezi različitih bolesti kao što su limfocitna leukemija i kolorektalni karcinom (Chang et al., 2018). Analiza RNK sekvence pokazuje da je ST8SIA1 visoko eksprimiran u tkivu dojke pacijenata sa TNBC i pozitivno je koreliran s mutacijama u genu tumor supresora p53, što može doprinijeti patogenezi TNBC (Battula et al., 2017). Osim toga, ST8SIA1 je uključen u metastaze i ponovnu pojavu TNBC, što sugerira da igra važnu ulogu u pojavi i razvoju TNBC. U in vitro modelu TNBC, pokazano je da suzbijanje ST8SIA1 pomoću CRIPSR/Cas9 blokira rast i metastaze (Battula et al., 2017). Ovo ukazuje na to da CRISPR/Cas9 može biti važan alat za inhibiranje funkcije onkogena ST8SIA1 u liječenju TNBC-a.
NAT1 je metabolički enzim koji katalizira formiranje ksenobiotskih spojeva faze II i eksprimira se u gotovo svim ljudskim tkivima. NAT1 može koristiti kofaktor folat za ciljanje acetil-CoA (acetil-CoA) čak i u odsustvu aromatičnog aminskog supstrata (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Studije su pokazale da NAT1 reguliše funkciju matriksne metaloproteinaze 9 (MMP9) u modelima ćelija raka dojke i štiti od reaktivnih vrsta kisika (ROS) tokom gladovanja glukozom (Wang et al., 2018). Pokazalo se da delecija NAT1 inhibira kompleks piruvat dehidrogenaze, što dovodi do mitohondrijalne disfunkcije (Wang L. et al., 2019). Osim toga, razni drugi izvještaji su pokazali da inhibicija NAT1 korištenjem malih molekula i utišavanja siRNA može smanjiti invazivnost i proliferaciju ćelija raka dojke (Stepp et al., 2018). Nedavno je CRISPR/Cas9 korišten za suzbijanje NAT1 u ćelijskoj liniji raka dojke MDA-MB-231, utičući na ćelijski metabolizam u zavisnosti od nivoa ekspresije. Ova studija je također pokazala da je NAT-1 ključan za progresiju i metastaze TNBC-a (Carlisle et al., 2020).
Koordiniranu transkripciju onkogena regulišu super pojačivači, transkripcijski faktori i kofaktori (Hnisz et al., 2015). Pored toga, za transkripcijsku regulaciju potrebna je grupa ciklin-zavisnih kinaza (CDK), kao što su CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 i CDK13. Među njima, CDK7 je uključena u fosforilaciju RNK polimeraze II, što je veoma važno za inicijaciju i širenje transkripcije onkogena u patogenezi TNBC-a. U jednoj značajnoj studiji, delecija CDK7 pomoću CRISPR/Cas9 inhibirala je TNBC, što ukazuje na to da je patogeneza TNBC-a zavisna od CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Studije su pokazale da mutacije u MYC i RBP (protein koji veže RNK) mogu dovesti do apoptoze, dok mutacije pojedinačnih gena u MYC ili RBP ne utiču na rast ćelija raka (Einstein et al., 2021). Više od 1000 RBP-ova u ljudskom genomu je pregledano korištenjem biblioteke zasnovane na CRISPR/Cas9. Među njima, utvrđeno je da je 57 RBP-ova kritično za rast ćelija raka sa visoko povišenim nivoima MYC (Wheeler et al., 2020). Pored toga, YTHDF2 je važan za održavanje rasta TNBC ćelija i smanjuje količinu metiliranih transkripata tokom transkripcije i translacije visokog nivoa u ćelijama raka sa višom ekspresijom MYC. Pored toga, YTHDF2 nije esencijalan za ćelije raka, koje su manje zavisne od povišenih nivoa MYC da bi produžile preživljavanje pacijenata sa TNBC (Einstein et al., 2021), što sugeriše da bi mogao biti potencijalna terapijska meta za lijekove koji mogu savladati TNBC.
Proteini cinkovih prstiju (ZNF) čine približno 1% ukupnog ljudskog genoma. Studije su pokazale da ZNF može regulirati proliferaciju ćelija u različitim vrstama raka, kao što su rak jetre, rak dojke i kolorektalni rak (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Biblioteke generirane CRISPR knockoutom korištene su za skrining različitih gena za supresiju tumora (TSG) u ćelijama raka dojke (Shalem et al., 2014). Od tada, transkriptomska studija ćelija raka dojke s delecijom CRISPR/Cas9 ZNF319 pokazala je da je ZNF319 gen za supresiju tumora koji smanjuje proliferaciju raka dojke i stoga je uključen u različite potencijalne mehanizme signalizacije i druge biološke funkcije (Wang L. et al., 2022).
Feroptoza je vrsta programirane ćelijske smrti koja zavisi od prisustva željeza. Poznato je da na razvoj feroptoze utiče prisustvo lipidnih peroksida. Osim toga, zabilježeno je da PKCβII pokazuje ranu lipidnu peroksidaciju, a povećana lipidna peroksidacija povezana je s feroptozom. Pregled biblioteke inhibitora kinaze posredovanih CRISPR/Cas9 otkrio je da je PKCβII uključen u proces lipidne peroksidacije, što je ključno za feroptozu u ćelijama MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Stoga, ovo sugerira da bi nokaut PKCβII pomoću CRISPR/Cas9 mogao biti potencijalna meta gena supresora tumora za liječenje bolesti povezanih s feroptozom (Zhang et al., 2022).
Vjeruje se da je otpornost na lijekove odgovorna za otprilike 90% smrtnih slučajeva kod pacijenata oboljelih od raka i jedan je od glavnih izazova u liječenju raka (Bukowski et al., 2020). Rezultati pokazuju da je dovoljan broj gena povezanih s izlučivanjem lijekova, popravkom DNK, apoptozom i različitim signalnim putevima ćelija povezan s otpornošću na lijekove (Haider et al., 2020). Među njima, nekoliko gena je ciljano CRISPR/Cas9 alatima i pokazali su obećavajuće rezultate u smanjenju otpornosti na lijekove i povećanju učinkovitosti tretmana protiv raka (Vaghari-Tabari et al., 2022). Osim toga, visokopropusne biblioteke za skrining knockouta CRISPR/Cas9 gena implicirane su u modificiranju funkcije potencijalnih ciljnih gena otpornosti na lijekove (Shalem et al., 2015). Za identifikaciju gena otpornosti na paklitaksel, korišteno je sekvenciranje RNK u kombinaciji sa skriningom biblioteke sgRNA na nivou cijelog genoma kako bi se identificiralo osam kandidatskih gena, uključujući histon deacetilazu 9 (HDAC9), koji su povezani s otpornošću na lijekove kod pacijenata s rekurentnim TNBC-om (B et al., 2020). U drugoj studiji, uočena je povećana ekspresija diserina/treonina i tirozin protein kinaze (DSTYK) tokom preživljavanja pacijenata s TNBC-om liječenih lijekovima protiv raka. Štaviše, CRISPR/Cas9-posredovano smanjenje ekspresije DSTYK značajno je poboljšalo apoptozu ćelija raka otpornih na lijekove in vitro (SUM102PT ćelije i MDA-MB-468 ćelije) i in vivo TNBC model (Ogbu et al., 2021).
Iako TNBC ima abnormalnu aktivaciju MAPK puta, klinički učinak terapija usmjerenih na MEK je slab. Skrining genomske biblioteke CRISPR/Cas9 otkrio je da inhibicija PSMG2 (šaperon 2 za sklapanje proteoma) senzibilizira TNBC BT549 i MB468 ćelije na inhibitor MEK AZD6244. Nokdaun PSMG2 pomoću CRISPR/Cas9 promijenio je normalnu funkciju proteasoma, što je dovelo do autofagijom posredovane demontaže PDPK1, čime se dodatno poboljšavaju tumorske ćelije u mišjim modelima TNBC-a inducirane AZD6244 (inhibitor MEK) i MG132 (inhibitor proteasoma). Stoga se inhibitori proteasoma i MAP kinaze (MEK) mogu sinergistički primjenjivati kako bi se smanjila proliferacija tumorskih ćelija (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 je također korišten za skrining gubitka genske funkcije što dovodi do rezistencije na TNBC (Shu et al., 2020). Ge i saradnici su objasnili mehanizam rezistencije na lijekove ćelija raka tretiranih sa JQ1, inhibitorom BET bromodomena (BBDI), kod TNBC. Koristeći CRISPR/Cas9, otkrili su da brisanje gena rb1 uzrokuje da TNBC postane otporan na lijek protiv raka JQ1. Stoga je funkcija rb1 važna u odgovoru na lijekove JQ1 kod TNBC. Također su izvijestili da je paklitaksel inhibitor CDK4/6 kinaze/mikrotubula, a njegova kombinacija sa BBDI-jima kao što je JQ1 može pružiti obećavajuće terapijske odgovore na TNBC otporan na lijekove (Ge et al., 2020).
Prijavljeno je da je transkripcijski pejzaž duge nekodirajuće RNK (lncRNA) odgovoran za otpornost na neoadjuvantnu terapiju kod TNBC-a. Ova studija pokazuje da je pet različitih MALAT1 lncRNA transkripata visoko eksprimirano u TNBC-u. Osim toga, delecija MALAT1 posredovana CRISPR/Cas9 povećala je osjetljivost TNBC BT-549 ćelija na paklitaksel i doksorubicin, što ukazuje na potencijalnu ulogu rezistencije na MALAT1 u TNBC-u (Shaath et al., 2021).
Mutacije u BRCA1 (BRCA1m) su heterogene i stoga ih je teško otkriti. Ciljanje PARP1 (poli(ADP-riboza) polimeraza), sintetičkog letalnog partnera BRCA1, može povećati kemosenzitivnost lijekova TNBC-a. Korištenjem CRISPR/Cas9, delecija PARP1 povećala je osjetljivost lijekova protiv raka kao što su doksorubicina, gemcitabina i docetaksela na mBRCA1 mutantne TNBC ćelije, što sugerira da je PARP1 također uključen u rezistenciju na lijekove kod TNBC-a (Vaghari-Tabari et al., 2022). Poznato je da mutacije u genima tumor supresora BRCA1 ili BRCA2 povećavaju vjerovatnoću razvoja raka dojke kod ljudi. Liječenje ovih pacijenata zahtijeva upotrebu PARP inhibitora. Osim toga, dokazano je da nokautiranje faktora spašavanja nukleotida DNPH1 korištenjem CRISPR/Cas9 može ukloniti toksični nukleotid 5-hidroksimetildeoksiuridin (hmdU) monofosfat, čime se pojačava odgovor ćelija s nedostatkom BRCA na osjetljivost na PARP inhibitore (Fugger i dr., 2021). Stoga, inhibitori CRISPR/Cas9 i PARP1 mogu postati važna strategija liječenja TNBC-a.
Gen za penetrantni glikoprotein (P-gp) je gen za višestruku rezistenciju na lijekove koji je generalno pojačano reguliran kod približno 41% svih TNBC-a (Sun et al., 2020). Izlučivanje lijekova izazvano P-gp-om identificirano je kao ključni regulator rezistencije na lijekove kod raka dojke. Inhibitori P-gp-a pokazali su povećanu osjetljivost na lijekove protiv raka dojke (Famta et al., 2021). Stoga, ablacija ili supresija P-gp-a i inhibitora P-gp-a posredovana CRISPR/Cas9-om mogu biti vrlo važne metode za prevazilaženje rezistencije na lijekove kod TNBC-a.
Poznato je da ATP-vezujući kasetni transporter G2 (ABCG2) uzrokuje rezistenciju na lijekove kod TNBC-a (Palasuberniam et al., 2015), iako trenutno nema izvještaja o vezi između CRISPR/Cas9 i utišavanja ABCG2 i inaktivacije gena tumor supresora. PTEN može pojačati aktivaciju ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Stoga, korištenje CRISP/Ca9 za uklanjanje ABCG2 i njegovo kombinovanje s inhibitorom ABCG2 može biti odgovarajući tretman za prevazilaženje rezistencije na lijekove kod TNBC-a. Tabela 2 spominje CRISPR/Cas9 koji cilja sve gene rezistencije.
Tabela 2. CRISPR/Cas9 cilja različite gene otpornosti na TNBC kako bi senzibilizirao ćelije na lijekove protiv raka.
CRISPR/Cas9 biblioteke su potencijalni alati za skrining genskih mutacija povezanih s patogenezom raka (Chan et al., 2022). Ova metoda skrininga uključuje četiri koraka kao što su (a) konstrukcija biblioteke, (b) lentivirusna transdukcija, (c) fenotipski skrining i (d) analiza ciljnih gena. Iako TNBC ima abnormalnu aktivaciju MAPK puta, klinička prognoza MEK ciljane terapije za TNBC pacijente koji nose mutacije u tumor supresorskim genima kao što su PTEN, RB1 i TP53 je vrlo loša.
Pored toga, skrining gena pomoću CRISPR/Cas9 testirao je najpotentniji i najselektivniji molekul, dehidrokatrol, koji je obilno prisutan u ekstraktima cvijeća i listova Gvatemale, kako bi se razumio učinak dehidrokatrola na MDA-MB-231. Mehanizmi selektivne citotoksičnosti ćelija. Karakteristike mezenhimalne matične strukture TNBC podtipova. Ovaj skrining zasnovan na CRISPR/Cas9 također je otkrio da je HSD17B11, gen koji kodira 17β-hidroksisteroid dehidrogenazu tip 11, visoko eksprimiran u MDA-MB-231 ćelijama i rezultira dehidrofalkarinolom specifičnim za MDA-MB-231 ćelije (Grant et. al., 2020). Dakle, ovo sugerira da genomski skrining CRISPR/Cas9 ima veliki potencijal u identifikaciji mehanizama koji leže u osnovi antikancerogenih svojstava potencijalnih prirodnih spojeva.
Pored toga, ranjivost TNBC-a na rak proučavana je korištenjem nepristrasnog in vivo CRISPR/Cas9 skrininga na nivou cijelog genoma, koji je pokazao vezu između onkogenih i tumor supresorskih puteva. Prijavljeno je da ključne komponente mTOR i Hippo puteva igraju važnu ulogu u regulaciji tumora kod TNBC-a. Osim toga, studije su pokazale da farmakološka inhibicija mTORC1/2 i YAP onkoproteina efikasno inhibira patogenost TNBC-a korištenjem in vitro modela sinergije lijek-matrica i in vivo ksenograftova izvedenih od pacijenata. Štaviše, inhibicija mTORC1/2 posredovana Torin-1 pojačava makropinocitozu, dok inhibicija YAP-a izazvana verteporfinom dovodi do smrti TNBC ćelija. Uzeti zajedno, ovi rezultati ističu snagu i robusnost in vivo CRISPR skrininga na nivou cijelog genoma za identifikaciju novih i efikasnih tretmana za TNBC (Dai et al., 2021).
Disregulacija imunološkog sistema je važan faktor u tumorogenezi. Ćelije raka izbjegavaju imunološki klirens zaobilazeći odbrambene mehanizme, uključujući ometanje aktivnosti imunoloških ćelija u mikrookruženju tumora i ugrožavanje imunološkog sistema. Stoga, razvoj poboljšanog imunološkog sistema može biti ključni pristup borbi protiv tumora. Upotreba genske modifikacije zasnovane na CRISPR/Cas9 rješava nekoliko problema povezanih s imunološkom disfunkcijom iz različitih perspektiva. CRISPR/Cas9 je korišten za poboljšanje antitumorskog imuniteta protiv raka dojke putem sljedećih puteva (Slika 3).
Slika 3. CRISPR/Cas9 imunoterapija cilja TNBC ćelije. Gubitak CDK5 i smanjenje ekspresije PDL1 i CD155 jačaju imunološki sistem. Slično tome, gubitak A2AR i smanjenje ekspresije TAA proteina kao što su HER2, mucin 1 i TEM8 povećali su efikasnost CAR-T ćelija u ubijanju ćelija raka. CRISPR/Cas9-vođeni skrining T ćelija pokazao je da poremećaj p38 kinaze pojačava antitumorsku aktivnost T ćelija. T ćelije modificirane CRISPR/Cas9 povećavaju ekspresiju TCR (receptora T ćelija), što rezultira antitumorskom aktivnošću T ćelija.
Cilj imunoterapije je stimulirati imunološki sistem da napadne ćelije raka. Prekomjerna ekspresija proteina imunoloških kontrolnih tačaka obično sprječava autoimune reakcije, ali može pomoći karcinomima da ih izbjegnu (Topalian et al., 2015). Ovi proteini sprječavaju imunološke reakcije vezivanjem za receptore na površini imunoloških ćelija. Višestruki proteini kontrolnih tačaka (kao što su CD155 i PD-L1) ciljaju PD-1 receptor na imunološkim ćelijama i eksprimiraju se u raku dojke, posebno TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Nokautiranje PD-L1 ili njegovog receptora korištenjem CRISPR/Cas9 može stimulirati imunološki sistem da napadne TNBC tumore (Yahata et al., 2019). Osim toga, pokazano je da smanjenje ekspresije PD-L1 putem CRISPR/Cas9-posredovane delecije CDK5 inhibira rast tumora in vitro i in vivo (Deng et al., 2020). Inhibicija rasta u in vitro i in vivo modelima raka dojke sugerira da bi smanjenje CD155 posredovano shRNA moglo imati terapijski učinak na rak dojke (Gao et al., 2018).
CAR T ćelije eksprimiraju CAR-ove koji prepoznaju antigene povezane s tumorom (TAA) i mogu koristiti eliminaciju proteina kontrolnih tačaka kako bi pojačali svoju aktivnost (Li C. et al., 2020). Postoje različite potencijalne mete za terapiju CAR T ćelijama kod raka dojke, uključujući nekoliko TAA kao što su HER2, mucin1 i TEM8 (Bajgain et al., 2018). Postoje dokazi da su CAR T ćelije koje ciljaju mezotelin (prekomjerno eksprimiran u TNBC BT-459 ćelijama) efikasnije protiv raka kada se PD-1 eliminira pomoću CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Međutim, izolacija T ćelija od pacijenata, a zatim njihovo ex vivo uređivanje je proces koji zahtijeva puno rada i vremena. Iako univerzalne T ćelije mogu smanjiti zahtjeve za izolacijom, donorske T ćelije koje eksprimiraju humani leukocitni antigen (HLA) klase I i T ćelijski receptor (TCR) treba ukloniti kako bi se spriječile abnormalnosti reakcije graft-versus-host (Ren et al., 2017a). Korištenjem CRISPR/Cas9, HDR može istovremeno eliminirati TCR i HLA te izbaciti gen koji kodira CAR. Studije su pokazale da se CRISPR/Cas9 može koristiti za uvođenje anti-CD19 CAR u TCR lokus, čime se efikasno proizvode CAR bez iscrpljivanja T ćelija (Dimitri et al., 2022). Razvijene su multipleks tehnologije za generiranje alogenih CAR T ćelija istovremenom eliminacijom TCR, beta-2-mikroglobulina (B2M), HLA-I podjedinice i drugih proteina poput PD-1 i CTLA-4, koji mogu imati veća antikancerogena svojstva protiv TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Korištenje CRISPR/Cas9 moglo bi poboljšati efikasnost CAR-T ćelija. Poznato je da adenozin ima imunosupresivna svojstva i može smanjiti antikancerogeni imunitet blokiranjem funkcije T ćelija i aktiviranjem adenozinskih A2A receptora (A2AR) (Vigano et al., 2019). Utišavanje A2AR pomoću CRISPR/Cas9 značajno je poboljšalo efikasnost CAR-T ćelija in vivo (Giuffrida et al., 2021). Poznato je da T ćelije pokazuju različite fenotipske karakteristike kao što su ćelijska ekspanzija, diferencijacija, oksidativni stres i genomski stres. Skrining T ćelija zasnovan na CRISPR/Cas9 otkrio je poremećaj 25 različitih kinaza receptora T ćelija. Među njima, pokazano je da delecija p38 kinaze pojačava antitumorsku aktivnost T ćelija, što ukazuje da je p38 kinaza ključni regulator regulacije CAR-T ćelija (Gurusamy et al., 2020).
T ćelije se mogu genetski modificirati korištenjem CRISPR/Cas9 kako bi se proizvele visoko eksprimirane TCR-ove. Transfer genetski modificiranih T ćelija pacijentima pokazao je jaču antikancerogenu aktivnost nego endogene T ćelije. Stoga, endogeni TCR-ovi mogu se takmičiti s genetski izmijenjenim TCR-ovima kod pacijenata, što može utjecati na potencijal imunoterapije raka. Da bi se prevladao ovaj problem, korištenje CRISPR/Cas9 za uklanjanje endogenog TCR-β u ćelijama primaocima i naknadni transfer TCR-β T ćelija pacijentima oboljelim od raka može pokazati bolje imunološke odgovore protiv raka bez potrebe za endogenom seksualnom konkurencijom TCR-a (Fan et al. 2018). Dakle, s izuzetkom CRISPR-modificiranih T ćelija, TCR-ovi su hiljadu puta osjetljiviji na tumorske antigene od normalnih TCR-transduciranih T ćelija. Osim toga, kod različitih leukemija, izmijenjene T ćelije generirane γδ TCR+ CRISPR-om pokazuju veću ekspresiju CD4+ i CD8+ T ćelija nego standardni TCR transfer (Legut et al., 2018). Dakle, modificirane T ćelije generirane CRISPR/Cas9 tehnologijom mogu biti efikasna metoda imunoterapije za prevazilaženje TNBC-a.
Integrini su molekule ćelijske adhezije koje su prisutne u ćelijskim transmembranama i promoviraju vezivanje ćelija za ekstracelularni matriks (ECM) (Hamidi i Ivaska, 2018). Disregulacija integrina povezana je s razvojem i migracijom raka promjenom ekstracelularnog matriksa, što dovodi do preživljavanja ćelija raka u cirkulaciji (Hamidi i Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-posredovano smanjenje ekspresije integrina usporava napredovanje tumora, metastaze i kolonizaciju kod TNBC-a. Prijavljeno je da smanjenje ekspresije integrina a5 (ITGA5) smanjuje migraciju i progresiju ćelija kod drugih karcinoma, poput raka pluća (Ju et al., 2017), što sugerira da integrin a5 također može biti ključni faktor u patogenezi TNBC-a.
Generiranje knockout miševa korištenjem tradicionalnih metoda embrionalnih matičnih (ES) ćelija je proces koji oduzima mnogo rada, vremena i je neefikasan. Potrebni su mjeseci i godine da se ES ćelije ciljaju homolognom rekombinacijom, uzgajaju himerni miševi, a zatim ukrste s heterozigotnim miševima kako bi se proizvelo homozigotno potomstvo. Za stvaranje miševa s višestrukim genetskim mutacijama potrebno je složeno ukrštanje. Međutim, mnogi problemi su se pojavili pri korištenju miševa generiranih ablacijom ES ćelija korištenjem CRISPR/Cas9 ili mikroinjektiranjem CRISPR/Cas9 komponenti u oplođene jajne ćelije jedne ćelije. Na primjer, uvođenje promjena često se događa na bialelnim lokusima i nije genski specifično. Nedavno je objavljeno da ES ćelije korištenjem CRISPR/Cas9 tehnologije mogu istovremeno umetnuti bialelne mutacije u do 5 gena (Nishizono et al., 2021). U tu svrhu, Cas9 mRNA i pet genski specifičnih gRNA su istovremeno transfektirane u ES ćelije. Ovo naglašava obećanje i efikasnost ovog postupka, iako su ove mutacije možda prenesene kada su osnivačke linije uzgajane kako bi se dobili miševi s peterostrukim knockoutom. Studija također izvještava o iznenađujućem otkriću: ES ćelije više nisu potrebne za stvaranje genetski modificiranih miševa. Umjesto toga, da bi se uklonili specifični genski proizvodi, Cas9 mRNA i gRNA su ubrizgane u embrije u stadiju jedne ćelije. Kao rezultat toga, stvorene su osnivačke linije s knockoutom koje se teoretski mogu koristiti za proučavanje posljedica delecije gena kod miševa (Qin et al., 2016). Dakle, CRISPR/Cas9 omogućava stvaranje transgeničnih miševa za liječenje TNBC-a po nižoj cijeni od tradicionalnog genetskog inženjeringa. Korištenjem CRISPR/Cas sistema, razvijen je novi model knockout miša koji može uspješno uvesti tačkaste mutacije u jednom ili više endogenih gena u TNBC-u. Na osnovu ovog koncepta, životinjski modeli TNBC-a također se mogu razviti korištenjem CRISPR/Cas9-posredovane delecije BRCA1 i p53, što rezultira gubitkom HR popravka, genomskom nestabilnošću i mutantnim fenotipovima (Annunziato et al., 2020).
Trenutno se za dijagnosticiranje TNBC-a koriste različite metode poput mamografije, magnetne rezonancije (MRI) i ultrazvuka. Međutim, ove metode imaju neka ograničenja. Mamografija se koristi za dijagnosticiranje lokalnog tkiva dojke, a ne metastaza, gdje su ćelije raka migrirale u druge organe. Ultrasonografija nije pouzdana metoda za dijagnosticiranje TNBC-a (Chen i Lee-Felker, 2023). MRI ima veću osjetljivost od ultrazvuka i mamografije, ali je njena dijagnostička tačnost ograničena (Sha i Chen, 2022). Biopsija tkiva je invazivan način identifikacije ćelija raka. Međutim, u nekim slučajevima, biopsija može propustiti kancerogeno tkivo ako igla skrene s područja interesa. Osim toga, vrlo je skupa i može biti traumatična za pacijenta. TNBC je heterogeni tip raka, tako da biopsija možda neće pružiti dovoljno informacija o vrsti raka. Stoga je hitno potrebna nova dijagnostički pouzdana metoda za otkrivanje TNBC-a. CRISPR/Cas9 može poslužiti kao visoko osjetljiva i minimalno invazivna alternativa za dijagnozu raka dojke. U tu svrhu, strategije zasnovane na CRISPR/Cas9 mogu se koristiti za poboljšanje PCR metoda za dijagnostiku TNBC-a. Prvo, proteini Cas9 i cpf1 iz CRISPR sistema se koriste za uklanjanje nespecifične DNK, a zatim ova dva proteina (Cas9 i cpf1) mogu prepoznati PAM sekvencu prije vezivanja za ciljnu DNK (Deepak Singh et al., 2021). Dakle, PCR može identificirati mutacije povezane s razvojem raka. Nekoliko studija je usvojilo ovu strategiju zasnovanu na CRISPR-u za detekciju različitih mutacija u različitim vrstama raka (Safari et al., 2019). Dakle, PCR metode zasnovane na CRISPR-u mogu smanjiti ovisnost dijagnoze TNBC-a o invazivnim metodama kao što je imunohistokemija zasnovana na biopsiji.
Genotipske promjene u regulaciji hormonskih receptora također su dokazane kod TNBC-a (Chen i Russo, 2009). PCR strategije zasnovane na CRISPR/Cas9 koje koriste mikročipove za dijagnostiku na mjestu pružanja njege mogu efikasno pratiti ove mutacije (Hajian et al., 2019). Također bi mogle pružiti zdravstvenim radnicima relevantne informacije o specifičnim mutacijama kod pacijenata sa TNBC-om, što bi moglo pomoći u poboljšanju njihovog toka liječenja. Međutim, ova kombinovana tehnika ima ograničenja. Stoga su potrebni opsežni istraživački napori prije nego što se ova CRISPR/Cas-PCR metoda može koristiti u zdravstvu za dijagnozu TNBC-a (Yang et al., 2019).
Vrijeme objave: 14. okt. 2024.